發(fā)布時間：2017-12-25 08:37

  本文關(guān)鍵詞：黃芪保心湯改善擴張型心肌病大鼠心室重構(gòu)及抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激凋亡的研究　出處：《南京中醫(yī)藥大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：背景擴張型心肌病(Dilated cardiomyopathy,DCM)是最常見的原發(fā)性心肌病,具有預后差,病死率高的特點,且發(fā)病逐年增長,嚴重威脅人類的健康。心室重構(gòu)(Ventricular remodeling,VR)是引起DCM心力衰竭的主要病理基礎,而抑制或逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)是DCM治療的關(guān)鍵。心室重構(gòu)機制復雜,與神經(jīng)-體液調(diào)節(jié)、細胞凋亡、炎癥因子等因素密切相關(guān)。細胞凋亡是心臟重構(gòu)最重要的機制之一。它與心力衰竭的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),抑制心肌細胞凋亡可以減輕心臟重構(gòu),改善心功能。近年來,在經(jīng)典的線粒體途徑和死亡受體凋亡途徑以外,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)通路的發(fā)現(xiàn),為細胞凋亡提供了新的信號途徑。研究認為通過抑制過度的ERS反應,可以減輕心肌細胞凋亡,并因此達到改善和逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)的目的。中醫(yī)藥對DCM有豐富的理論研究和治療經(jīng)驗,具有多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點、安全有效的治療特點,為DCM的現(xiàn)代治療提供新的方向。黃芪保心湯是張培影教授根據(jù)中醫(yī)基礎理論,結(jié)合多年臨床經(jīng)驗研發(fā)的經(jīng)驗方,臨床應用多年療效顯著。前期臨床研究表明其可改善DCM患者心功能及預后,抑制患者心肌纖維化,并通過初步基礎實驗驗證其抗心肌纖維化的作用機制。鑒于前期的臨床及基礎工作,設想黃芪保心湯能抑制神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)激活,逆轉(zhuǎn)DCM心室重構(gòu)的發(fā)生,且其分子作用機制可能與其抑制ERS介導心肌細胞凋亡相關(guān)。因此本研究采用阿霉素造模建立DCM大鼠模型,探索黃芪保心湯抑制神經(jīng)內(nèi)分泌因子、改善DCM大鼠心室重構(gòu)的作用,并從ERS介導的細胞凋亡途徑入手,探討黃芪保心湯改善DCM大鼠心室重構(gòu)的分子機制。同時采用血清藥理學和血清藥理化學的方法,以大鼠為含藥血清的供體,以體外原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞作為研究的對象,通過給予血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導,建立心肌細胞凋亡模型,研究黃芪保心湯含藥血清對AngⅡ誘導的心肌細胞凋亡及ERS相關(guān)凋亡蛋白的影響,從細胞層面探討黃芪保心湯通過抑制ERS介導細胞凋亡達到抑制心室重構(gòu)的分子機制。本研究分為以下四個部分:實驗一:黃芪保心湯改善DCM大鼠心室重構(gòu)作用的研究目的:驗證黃芪保心湯抑制RAAS系統(tǒng)激活,改善DCM大鼠心室重構(gòu)的作用方法:通過對90只SD大鼠腹腔注射阿霉素(2.5 mg/kg,每周1次,共8次)建立DCM模型,彩超驗證后成模共計55只,隨機分組給藥如下:模型組(等量無菌水)、黃芪保心湯低、中、高劑量組(分別予5.67g、11.34g、22.68g生藥/kg),卡托普利組(6.75 mg/kg),每組11只,每天灌胃給藥1次,連續(xù)4周。另設正常對照組大鼠10只(等量無菌水灌胃)。4周后,超聲心動圖檢測左室結(jié)構(gòu)及功能變化;頸動脈插管檢測血流動力學指標;觀察心臟大體形態(tài)并稱重測心重指數(shù);通過HE染色、Masoon染色觀察心肌組織形態(tài)學改變;ELISA法檢測血清N末端腦鈉肽前體(NT-proBNP)、基質(zhì)裂解素2(ST2)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、醛固酮(ALD)、腎素活性(Renin)水平;考馬斯亮蘭法測定心肌細胞超氧化物歧化酶(SOD)活性,脂質(zhì)過氧化物丙二醛(MDA)和乳酸脫氫酶(LDH)含量。結(jié)果:與正常組比較,模型組大鼠LVEDD、LVESD增高,EF、FS及SV值降低(P0.01);LVDP、±dp/dtmax減低,LVEDP升高(P0.01);心臟形態(tài)變大,心重指數(shù)增大(P0.01);心肌細胞排列紊亂,大量纖維組織增生;血NT-proBNP、ST2、Renin、AngⅡ、ALD水平均升高(P0.01);SOD水平降低,MDA、LDH升高(P0.01)。與模型組比較,黃芪保心湯低、中、高劑量組可不同程度地降低大鼠LVEDD、LVESD,升高 EF、FS、SV 值(P0.05,P0.01);升高 LVDP、±dp/dtmax,降低 LVEDP(P0.05,P0.01);降低HWI和LVMI(P0.05,P0.01);心肌細胞排列整齊,纖維組織增生減輕;使血 NT-proBNP、ST2、Renin、AngⅡ、ALD 水平不同程度下降(P0.05,P0.01);降低MDA和LDH,并升高SOD水平(P0.05,P0.01)。低、中、高劑量組呈一定的劑量-效應關(guān)系,高劑量組最優(yōu),結(jié)果與陽性藥物組比較無統(tǒng)計學差異(P0.05)。結(jié)論:黃芪保心湯可改善擴張型心肌病大鼠心臟擴大、纖維化增生及心功能,通過調(diào)控氧化因子、抑制RAAS系統(tǒng)神經(jīng)內(nèi)分泌因子激活,改善心功能,抑制心室重構(gòu)。實驗二:黃芪保心湯抑制DCM大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激細胞凋亡機制的研究目的:驗證黃芪保心湯抑制DCM大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激細胞凋亡的作用機制。方法:本研究采用實驗一中保存的各組組織標本,通過TUNEL染色,檢測組織心肌細胞的凋亡水平,予免疫組化法和Western blotting法,檢測凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax、Caspase-3的蛋白表達水平,并予Western blotting檢測ERS分子伴侶GRP78及下游CHOP、Caspase-12凋亡通道蛋白表達水平。結(jié)果:與正常組比較,模型組心肌細胞凋亡水平明顯增加(P0.01);組織中促凋亡因子Bax和Caspase-3的蛋白表達增加,而抗凋亡因子Bcl-2降低(P0.05);而心肌組織中GRP78、Caspase-12和CHOP的蛋白表達水平增加(P0.05)。與模型組比較,低、中、高劑量組黃芪保心湯可不同程度地降低心肌細胞凋亡水平(P0.05.,P0.01);但低劑量組對凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax、Caspase-3無明顯改善(P0.05),中、高劑量組可明顯降低促凋亡因子Bax和Caspase-3的蛋白表達水平,升高抗凋亡因子Bcl-2的表達水平(P0.05);低劑量組對心肌組織中的GRP78、Caspase-12和CHOP的蛋白表達水平無明顯改善(P0.05),中、高劑量組可不同程度降低心肌組織中ERS分子伴侶GRP78和Caspase-12、CHOP凋亡通道蛋白的表達(P0.05),各劑量組結(jié)果呈一定的劑量-效應關(guān)系,高劑量組最優(yōu),結(jié)果與陽性藥物組比較無統(tǒng)計學差異(P0.05)。結(jié)論:阿霉素誘導DCM模型大鼠中存在ERS介導細胞凋亡的發(fā)生,而黃芪保心湯可能通過抑制ERS,降低分子伴侶GRP78的蛋白表達,抑制下游的Caspase-12和CHOP凋亡通路蛋白表達,而上調(diào)Bcl-2表達,下調(diào)Bax表達,同時下調(diào)Caspase-3蛋白表達而起到抑制心肌細胞凋亡作用。實驗三:黃芪保心湯含藥血清對AngⅡ誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激心肌細胞凋亡的影響目的:驗證黃芪保心湯含藥血清抑制AngⅡ誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激心肌細胞凋亡的作用。方法:1.原代培養(yǎng)乳鼠心肌細胞及鑒定。對新生乳鼠進行體外心肌細胞的原代培養(yǎng),予臺盼蘭活力檢測,并予形態(tài)學及α-actin染色鑒定。2.建立AngⅡ誘導凋亡心肌細胞模型。予不同濃度AngⅡ、不同時間培養(yǎng),并對培養(yǎng)后的心肌細胞TUNEL染色,檢測出TUNEL染色中陽性細胞比例最高的實驗條件,并以該條件卜的AngⅡ濃度和培養(yǎng)時間作為本實驗最適濃度和最佳時間,進行造模。3.黃芪保心湯含藥血清的制備方法及體系中血清添加量的確定。正常SD大鼠黃芪保心湯濃縮液灌胃給藥,每日2次,連續(xù)給藥7天,于末次給藥后采血。無菌條件下分離血清,濾過后凍存。通過MTT法細胞活性檢測確定體系中最佳空白血清添加量。HPLC法確定給藥后最佳采血時間。SD大鼠灌胃,據(jù)末次給藥后間隔時間分組取血,檢測不同采血時間點含藥血清的HPLC色譜圖,以"歸一化法"記錄各時間點色譜峰的總面積,通過對不同采血時間點色譜圖總面積的計算比較,最后確定最佳采血時間。4.黃芪保心湯含藥血清的制備及分組。32只雄性SD大鼠,隨機分成4組,每組8只。分別為空白血清組、低劑量含藥血清組(28.25 g/kg)、中劑量含藥血清組(56.5 g/kg)及高劑量含藥血清組(113 g/kg)。各給藥組按照相應劑量分別灌胃給藥,空白對照組給予相同體積的無菌水,連續(xù)7天,每天2次。在末次給藥后60 min,對大鼠進行下腔靜脈采血,無菌制備空白血清及黃芪保心湯低、中、高劑量組含藥血清。5.體外原代培養(yǎng)并鑒定的心肌細胞,分7組分別為:正常對照組、空白血清組、AngⅡ組、低、中、高劑量含藥血清組和卡托普利組,后5組予上條件下AngⅡ誘導的凋亡心肌細胞。上7組培養(yǎng)24 h后,采用Annexin V-FITC/PI凋亡流式檢測各組細胞凋亡水平,并通過Western blotting法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bc1-2、Bax及Caspase-3的表達水平,同時予Western blotting法檢測ERS分子伴侶GRP78、相關(guān)凋亡通道蛋白Caspase-12和CHOP等的蛋白表達。結(jié)果:1.心肌細胞培養(yǎng)成功,臺盼蘭染色法檢測細胞活力≥90%,α-actin染色鑒定顯示心肌細胞陽性率≥95%。本實驗AngⅡ造模最佳濃度為10-7 mol/L,最佳時間為24 h。TUNEL示凋亡比例最高。2.體系中加入血清的最佳比例為20%,該條件下血清對乳鼠心肌細胞正�；钚曰緹o明顯影響。HPLC法確定按人臨床用藥等效劑量的5倍,每日兩次、連續(xù)7天灌胃給藥,于末次給藥60 min時采血所得的含藥血清中成分的總峰面積最大。3.與正常對照組比較,空白血清組心肌細胞凋亡水平、Bcl-2、Bax、Caspase-3、GRP78、Caspase-12和CHOP變化均無統(tǒng)計學意義(P0.05)。與正常對照組比較,AngⅡ組心肌細胞凋亡水平明顯增加(P0.01);促凋亡因子Bax和Caspase-3蛋白表達增加,抗凋亡因子Bcl-2降低(P0.05);ERS相關(guān)凋亡因子GRP78、Caspase-12和CHOP蛋白表達增加(P0.05)。與AngⅡ組相比,低、中、高劑量組含藥血清可不同程度降低細胞凋亡水平(P0.01);但低劑量組對 Bcl-2、Bax、Caspase-3、GRP78、Caspase-12 和 CHOP 的蛋白表達水平無明顯改善(P0.05),而中、高劑量組可明顯降低促凋亡因子Bax和Caspase-3的蛋白表達,上調(diào)抗凋亡因子Bcl-2的蛋白表達(P0.05);降低GRP78、Caspase-12和CHOP蛋白表達水平(P0.05)。上述作用呈一定的劑量依賴性,高劑量組與陽性藥物卡托普利組無統(tǒng)計學差異。(P0.05)結(jié)論:AngⅡ可誘導ERS介導細胞凋亡的發(fā)生,而黃芪保心湯可抑制AngⅡ誘導的心肌細胞凋亡。其機制可能是通過抑制ERS,降低分子伴侶GRP78表達水平,抑制下游的Caspase-12和CHOP凋亡通路,進而上調(diào)Bcl-2表達水平,降低Bax、Caspase-3的蛋白表達而起到抑制心肌細胞凋亡作用。
【學位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

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