本文關(guān)鍵詞：退變椎間盤終板軟骨細胞衰老及調(diào)控機制研究　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的:觀察退變椎間盤終板軟骨細胞衰老的表現(xiàn)以及氧化應(yīng)激對終板軟骨細胞衰老的影響,探討SIRT1對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的終板軟骨細胞衰老的調(diào)控作用以及相關(guān)機制,為進一步揭示椎間盤軟骨終板的退變機制提供相關(guān)實驗基礎(chǔ)。方法:取因腰椎爆裂骨折(LVF組,退變輕)及椎間盤退變性疾病(DDD組,退變嚴(yán)重),行椎間盤切除術(shù)的椎間盤組織分離得到終板軟骨組織,進行大體標(biāo)本觀察、組織學(xué)檢測(常規(guī)HE染色,免疫組織化學(xué)染色),觀察不同退變程度終板軟骨組織中細胞的外形及SIRT1、p53、p21、p16蛋白表達情況。提取原代終板軟骨細胞,進行細胞擴增、培養(yǎng);并采用致死量以下的H2O2進行氧化應(yīng)激處理,觀察對細胞的影響,構(gòu)建細胞衰老模型;并采用流式細胞儀、衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色、定量PCR、WB等方法檢測細胞的凋亡、周期分布,以及細胞衰老相關(guān)信號通路的激活情況。構(gòu)建高表達SIRT1的腺病毒Ad-SIRT1并驗證其表達及功能,以ad-gfp為對照,并應(yīng)用sirt1基因特異性抑制劑nicotinamide、p53特異性抑制劑pft-α,調(diào)控sirt1表達及衰老相關(guān)信號通路的活性后,采用流式細胞儀、衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色、免疫熒光、定量pcr、wb等方法檢測細胞的周期分布,以及衰老相關(guān)基因的表達的定位及定量情況。進而探討sirt1對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的終板軟骨細胞衰老的調(diào)控作用及機制。結(jié)果:DDD組椎間盤終板軟骨組織較lvf組顏色偏黃,鈣化明顯,he染色顯示其大多細胞相對變扁,而lvf組細胞相對成圓形。免疫組織化學(xué)提示ddd組sirt1陽性細胞率較lvf組明顯減少(p0.05),而ddd組p53、p21的陽性細胞率較lvf組明顯增加(p0.05),而p16的陽性細胞率兩組中尚未見明顯差異(p0.05),ddd組原代細胞中衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色陽性細胞率明顯高于lvf組(p0.05)。致死量以下H_2O_2進行氧化應(yīng)激處理終板軟骨p2代細胞后,兩組(control組、H_2O_2組)細胞凋亡率未見明顯差異(p0.05),而細胞周期中g(shù)1期細胞的比例H_2O_2組明顯高于control組(p0.05),且衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色陽性細胞率H_2O_2組明顯高于control組(p0.05),并且H_2O_2組中ii型膠原的表達明顯降低,而mmp13的表達明顯增高;p53乙�；郊皃21的mrna及蛋白水平H_2O_2組都明顯高于control組(p0.05),p38磷酸化水平及p16的mrna及蛋白水平H_2O_2組與control組未見明顯差異(p0.05)。腺病毒過表達sirt1后,H_2O_2+ad-sirt1組較對照組(H_2O_2組)明顯抑制p53乙�；郊耙种苝21的表達(p0.05),同時降低β-半乳糖苷酶染色陽性細胞率(p0.05),并使得細胞周期中g(shù)1期細胞的比例明顯降低(p0.05);而H_2O_2+nic組抑制sirt1的表達后,較對照組(H_2O_2組)明顯增加了p53乙�；郊皃21的表達(p0.05),衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色陽性細胞率增高(p0.05),同時細胞周期中g(shù)1期細胞的比例明顯增高(p0.05)。在氧化應(yīng)激條件,細胞免疫熒光染色提示sirt1定位于細胞核內(nèi),而p53出現(xiàn)明顯向細胞核內(nèi)聚集,進一步提示sirt1與p53可能存在相互作用。而H_2O_2+nic+pft-α組在氧化應(yīng)激下使用nic抑制sirt1,激活p53/p21信號通路后,再使用p53特異性抑制劑pft-α后,p21的表達水平較H_2O_2+nic組明顯降低(p0.05),同時衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色陽性細胞率降低(p0.05),細胞周期中g(shù)1期細胞的比例也明顯降低(p0.05),同時與單純氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細胞衰老后直接加入pft-α即H_2O_2+pft-α組比較,p21的表達水平、衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色陽性細胞率、g1期細胞的比例并無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。進一步提示p53/p21是sirt1調(diào)控氧化應(yīng)激條件下終板軟骨細胞衰老的重要信號通路。結(jié)論:退變椎間盤終板軟骨細胞存在明顯衰老表型,而氧化應(yīng)激條件下p53/p21信號通路在終板軟骨細胞衰老調(diào)控中有著重要的作用,sirt1可通過p53/p21信號通路緩解氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞衰老,這為進一步探討椎間盤終板軟骨的退變提供相關(guān)實驗基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R681.53

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本文編號：1331093