本文關鍵詞：脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮對昆明小鼠和巨噬細胞ANA-1代謝組的聯(lián)合毒性機制研究　出處：《江南大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：真菌毒素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)和玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)是全球污染最為嚴重的兩類真菌毒素,尤其是北歐和北亞;在我國部分地區(qū),其污染程度高達到100%。它們在基質中共存的特性引發(fā)的一系列聯(lián)合效應,成為了近年來真菌毒素毒性研究的重點。大多數(shù)混合毒素聯(lián)合效應都表現(xiàn)為多重效應現(xiàn)象,即在不同的濃度劑量、不同的毒素組合、不同的細胞模型以及不同的毒性作用時間可表現(xiàn)不同的聯(lián)合效應結果:拮抗、加和、協(xié)同。本研究擬從代謝組的角度,剖析真菌毒素DON和ZEN在小鼠和細胞內的代謝組層次聯(lián)合毒性效應,結合代謝組學、生物信息學,為真菌毒素DON和ZEN的聯(lián)合毒性效應機制研究提供新的思路。其主要結論如下:1.真菌毒素DON和ZEN對小鼠血清和肝臟代謝組的影響表現(xiàn)為拮抗效應。在血清生化指標檢測中,肝臟及腎臟病變指標在單一毒素組顯著上調,在聯(lián)合毒素組表現(xiàn)正�；驘o顯著性變化,如堿性磷酸酶、丙氨酸轉氨酶、白蛋白等。肝臟病理切片結果,單一毒素可以誘發(fā)肝臟出現(xiàn)炎癥細胞浸潤癥狀和上皮細胞壞死癥狀,聯(lián)合毒素組肝臟組織只出現(xiàn)輕微的炎癥細胞浸潤癥狀。熱圖分析和代謝通路分析表明,單一毒素組肝臟和血清中顯著性變化的代謝物以及富集的代謝通路均多于聯(lián)合毒素組。單一毒素DON組可以引起肝臟中L-絲氨酸、L-亮氨酸、丙酮酸、L-脯氨酸、馬尿酸、苯丙氨酸等代謝物濃度顯著性下調,以及O-糖基類代謝物顯著性下調,包括乳果糖、D-海藻糖、塔羅糖、槐糖;在聯(lián)合毒素組無顯著性。血清代謝物分析結果顯示,肌酸酐、苯丙氨酸、L-正亮氨酸、L-焦谷氨酸、L-甲硫氨酸、香葉醇等代謝物,只在單一毒素組中具有顯著性。少部分代謝物在聯(lián)合毒素組具有顯著性,比如煙酰胺、3-吲哚乳酸、2-羥基吡啶。2.DON在實驗劑量下未發(fā)現(xiàn)腎臟和脾臟的臟器比以及腎臟病變的生化指標,尿素氮和肌苷酸的顯著性變化,但是通過代謝組分析發(fā)現(xiàn),真菌毒素DON對小鼠肝臟和脾臟的代謝功能的影響。通過對腎臟和脾臟代謝物的多元變量統(tǒng)計分析,發(fā)現(xiàn)毒素DON組和對照組存在顯著的主成分差異;結合代謝通路富集分析顯示,腎臟中纈氨酸,亮氨酸和異亮氨酸生物合成途徑以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝,受到影響;脾臟中纈氨酸,亮氨酸和異亮氨酸生物合成途徑以及亞油酸代謝,是最為異常的代謝通路。整合代謝通路分析表明,腎臟中L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-纈氨酸、L-谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、馬尿酸、丙酮酸等氨基酸和有機酸顯著性下調;葡萄糖酸、半乳糖醛酸、核糖醇、甘油1-磷酸酯也顯著下調。脾臟組織中檢測到的總代謝物少于腎臟組,大多數(shù)氨基酸和有機酸均顯示下降趨勢,如L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-亮氨酸、L-纈氨酸、馬尿酸、苯丙氨酸、花生酸、辛酸、亞油酸和十七烷酸等;部分脾臟代謝物顯示上調趨勢,包括氨基酸,如正纈氨酸、環(huán)亮氨酸等;有機酸,如丙酮酸、草酸等;許多酚類和醇類物質,如3-甲基丙醇、百里酚、膦酰霉素、1-茚醇。3.從小鼠尿液代謝物反映真菌毒素持續(xù)作用小鼠代謝組隨時間的變化趨勢。通過對DON持續(xù)作用小鼠尿液代謝物的檢測,PCA結果顯示,小鼠尿液中代謝物的主成分呈現(xiàn)明顯的時間效應現(xiàn)象,隨著時間的增加,代謝物主成分呈線性平移分布。小鼠尿液代謝物通路富集分析表示,尿液中受影響得分最高的三個代謝通路為,泛醌等萜醌類生物合成、苯丙氨酸代謝、檸檬酸循環(huán)。代謝物與疾病分析結果顯示,DON持續(xù)誘導或促使小鼠發(fā)生酪氨酸血癥,該疾病代謝標志物,對羥基苯基乙酸、4-羥苯丙酮酸、焦谷氨酸在DON誘導小鼠尿液代謝組中異常;此外,焦谷氨酸酶缺乏癥以及原發(fā)性膽汁性肝硬化代謝標志物,焦谷氨酸和苯丙酮酸均在DON組小鼠尿液代謝物中表現(xiàn)異常。小鼠尿液整合代謝通路分析結果表示,DON作用的前48小時,受干預代謝通路主要是,苯丙氨酸代謝、檸檬酸循環(huán)、丙酮酸的代謝;隨著作用時間持續(xù)到7天,糖類代謝通路,如糖酵解或糖異生、氨基糖和核苷酸糖的代謝開始出現(xiàn)異常,表現(xiàn)為蔗糖、海藻糖、塔洛、塔格糖等代謝物的顯著性下調。4.小鼠尿液代謝物研究發(fā)現(xiàn)真菌毒素DON和ZEN對小鼠代謝組的毒性表現(xiàn)為拮抗效應。通過對第21天小鼠尿液代謝物的檢測,結合多元變量統(tǒng)計分析,可以發(fā)現(xiàn)單一毒素組尿液主成分與對照組,可以通過主成分分析以及聚類分析分離,而聯(lián)合毒素組不能與對照組分離。通過對三個劑量組中受到影響的代謝物做通路富集,發(fā)現(xiàn)受到干預的代謝通路有,半乳糖代謝、抗壞血酸和醛酸代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、TCA循環(huán)、纈氨酸,亮氨酸和異亮氨酸生物合成、泛醌和其他萜類化合物-醌生物合成、甘油脂代謝、亞油酸代謝和甲烷代謝等。整合代謝通路分析結果表示,單一毒素組上調的尿液代謝物遠超過聯(lián)合毒素組;單一毒素組中,半乳糖及其下游代謝物,包括甘露醇、半乳糖酸、肌醇、塔格糖,相比于聯(lián)合毒素DON+ZEN而言,表現(xiàn)為更顯著的下降趨勢;異亮氨酸、丙氨酸以及其相關�；惏被�,包括N-乙酰基-L-谷氨酸、L-乙酰基-天冬氨酸等,僅在單一毒素組表現(xiàn)異常。真菌毒素DON和ZEN在本實驗劑量設置下,尿液代謝物分析結果表現(xiàn)為拮抗作用。5.通過細胞存活率篩選對真菌毒素敏感的細胞模型巨噬細胞ANA-1,結合細胞凋亡實驗優(yōu)化體外代謝實驗真菌毒素劑量濃度。通過OPLS-DA和S-plot篩選巨噬細胞胞內胞外單一毒素和聯(lián)合毒素組的顯著性代謝差異物,結合韋恩圖分析、熱圖分析和代謝通路富集分析,發(fā)現(xiàn)甘氨酸,絲氨酸和蘇氨酸代謝以及苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸代謝是最主要的兩條受到干擾的代謝通路。單一毒素DON誘導胞外代謝物天冬氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、氧脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸等氨基酸的顯著性上調,丙酮酸和1,5-脫水葡萄糖醇濃度下調;胞內代謝物中,糖類代謝物顯著性下調,包括葡萄糖酸、葡萄糖、肌醇、核糖等。在單一毒素ZEN組中表現(xiàn)為雌激素效應標志物雌二醇上調;聯(lián)合毒素DON+ZEN抑制ZEN的雌激素效應,加深了對戊糖磷酸途徑、棕櫚酸代謝的干擾,表現(xiàn)為核糖5-磷酸、2-脫氧-D-半乳糖以及棕櫚酸、1-單棕櫚酸顯著性變化。
【學位授予單位】：江南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R155

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