本文關(guān)鍵詞：野百合堿誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓大鼠右室心肌細(xì)胞自噬及調(diào)控機(jī)制的研究　出處：《廣西醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：肺動(dòng)脈高壓(Pulmonary artery hypertension,PAH)是一種進(jìn)行性的肺血管與心臟結(jié)構(gòu)功能異常的病理生理綜合征。盡管肺血管損害是PAH原發(fā)病變,然而患者的臨床預(yù)后主要取決于右心室的功能狀態(tài)。目前,臨床上PAH的藥物主要為抑制肺血管平滑肌細(xì)胞增殖與肺血管收縮,此類藥物能降低肺動(dòng)脈壓、緩解PAH患者的癥狀與改善生活質(zhì)量,但并不能有效逆轉(zhuǎn)患者右心室功能狀態(tài)與臨床預(yù)后。臨床上對(duì)右心室重構(gòu)機(jī)制及藥物治療的認(rèn)識(shí)均源于左心室。遺憾的是,PAH右心室重構(gòu)可能存在與壓力負(fù)荷左心室并不完全相同的機(jī)制,因此大部分治療左心衰的藥物對(duì)右心衰并無(wú)效果。深入研究PAH右室重構(gòu)的細(xì)胞和分子機(jī)制為PAH治療藥物篩選,開(kāi)發(fā)右室特異性藥物、逆轉(zhuǎn)右室重構(gòu),從而改善患者預(yù)后具有重要的科學(xué)意義及臨床價(jià)值。自噬是一種酵母至哺乳動(dòng)物進(jìn)化過(guò)程中形成的,通過(guò)細(xì)胞內(nèi)雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體包裹細(xì)胞成份,并與溶酶體相溶合、從而形成自噬溶酶體,籍此降解與再循環(huán)長(zhǎng)壽命蛋白與細(xì)胞器的生命活動(dòng)過(guò)程。目前證實(shí),自噬與細(xì)胞存亡調(diào)控存在密切關(guān)系,參與了多種結(jié)構(gòu)性心臟病心臟重構(gòu)。右室心肌缺血、缺氧是PAH右室重構(gòu)重要的病理生理基礎(chǔ)。磷酸腺苷活化的蛋白激酶(Adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)與缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,Hif1-α)/腺病毒E1B 19 k Da蛋白相互作用蛋白3(Adenovirus E1B 19-k Da interacting protein 3,BNIP3)/Beclin-1是缺氧條件下細(xì)胞自噬激活的兩條重要信號(hào)通路。但PAH右室重構(gòu)過(guò)程中右室心肌細(xì)胞自噬時(shí)序性變化?以上兩條信號(hào)通路是否參與PAH右室心肌自噬調(diào)控?不同信號(hào)通路激活自噬對(duì)心肌細(xì)胞的作用如何?尚未闡明。本課題在建立野百合堿(Monocrotaline,MCT)誘導(dǎo)PAH大鼠模型及缺氧培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上,通過(guò)以下三部分的實(shí)驗(yàn),初步探討PAH右心室重構(gòu)發(fā)展過(guò)程中心肌自噬變化規(guī)律、可能調(diào)控機(jī)制及其生物學(xué)作用。該研究結(jié)果將為PAH治療藥物篩選,開(kāi)發(fā)右室特異性自噬調(diào)控藥物、防治PAH右室重構(gòu)與功能異常提供初步理論依據(jù)與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。第一部分野百合堿誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓大鼠模型建立及右室心肌缺氧相關(guān)指標(biāo)變化。目的:建立野百合堿誘導(dǎo)PAH大鼠模型,觀察PAH大鼠右室結(jié)構(gòu)、功能變化;并探討PAH大鼠右室心肌細(xì)胞缺氧相關(guān)指標(biāo)變化。方法:60只8周齡雄性Sprague Dawley(SD)大鼠隨機(jī)分為MCT組(n=36)及對(duì)照組(n=24)。兩組動(dòng)物均設(shè)2、4、6周3個(gè)時(shí)點(diǎn)亞組;MCT組每個(gè)時(shí)點(diǎn)亞組12只,對(duì)照組每個(gè)時(shí)點(diǎn)亞組8只。采用經(jīng)項(xiàng)背部皮下注射MCT(60mg/kg)建立肺動(dòng)脈高壓模型(MCT組),對(duì)照組(CON組)注射等量生理鹽水。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)對(duì)存活大鼠行超聲心動(dòng)圖檢查,測(cè)量右室結(jié)構(gòu)與功能參數(shù);右心導(dǎo)管檢測(cè)肺動(dòng)脈收縮壓(Pulmonary artery systolic pressure,PASP)、肺動(dòng)脈平均壓(Pulmonary artery mean pressure,PAMP);測(cè)量右室肥厚指數(shù);蘇木精—伊紅染色(Hematoxylin-eosin staining,HE)染色了解肺血管及右室心肌組織病理改變,測(cè)量肺血管阻塞率,心肌細(xì)胞直徑,Masson染色檢測(cè)心肌膠原含量。麥胚凝集素染色(Wheat germ agglutinin staining,WGA)檢測(cè)右室心肌細(xì)胞面積大小;CD31免疫熒光染色檢測(cè)心肌毛細(xì)血管生成;用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR)、免疫組化與蛋白質(zhì)印跡(Western blot)檢測(cè)心肌肌紅蛋白(myoglobin)的m RNA與蛋白表達(dá)。結(jié)果:與對(duì)照組相比,MCT大鼠PASP、PAMP均顯著增高,以6周組為著。MCT大鼠2周時(shí)右室心肌輕度肥厚、右室收縮功能維持正常;4周右室擴(kuò)大,心室明顯肥厚、收縮功能輕度減低;6周時(shí)右室顯著擴(kuò)大重構(gòu)、心功能顯著降低并出現(xiàn)右心衰癥狀。組織病理學(xué)上,MCT大鼠肺動(dòng)脈血管阻塞率較對(duì)照組增高并持續(xù)增加;2周始右室心肌細(xì)胞直徑及面積輕度增大,4周與6周最為顯著。MCT大鼠2周亞組右室心肌膠原含量與對(duì)照組無(wú)顯著差異,而4與6周亞組MCT顯著增多。與對(duì)照組相比,MCT大鼠的2周亞組心肌毛細(xì)血管數(shù)目、myoglobin的m RNA及蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而4周與6周亞組則顯著降低。結(jié)論:MCT成功構(gòu)建PAH大鼠模型,復(fù)制PAH右室重構(gòu)的發(fā)展過(guò)程。MCT大鼠2周出現(xiàn)右室心肌細(xì)胞肥大;而4周及6周時(shí)心肌細(xì)胞持續(xù)增大、毛細(xì)血管減少與心肌myoglobin水平降低誘導(dǎo)右室心肌缺血、缺氧是PAH右室重構(gòu)的重要病理生理基礎(chǔ)。第二部分肺動(dòng)脈高壓大鼠右室心肌細(xì)胞自噬變化及可能的調(diào)控通路目的:探討PAH大鼠右室重構(gòu)過(guò)程中,右室心肌細(xì)胞自噬時(shí)序性變化規(guī)律及其與肺動(dòng)脈收縮壓的關(guān)系;闡明缺氧相關(guān)自噬信號(hào)通路在PAH大鼠右室心肌自噬的調(diào)控作用。方法:動(dòng)物造模與分組同第一部分。RT-q PCR檢測(cè)右室與左室心肌自噬標(biāo)志蛋白-微管相關(guān)輕鏈蛋白3(Microtubule associated light chain protein 3,LC3)m RNA水平;免疫組化及Western blot檢測(cè)LC3蛋白表達(dá);western blot檢測(cè)自噬體降解標(biāo)志蛋白P62表達(dá);透射電鏡觀察右室心肌細(xì)胞自噬體形態(tài)與數(shù)目。Western blot檢測(cè)右室心肌AMPK/m TOR及Hif-1α/BNIP3/Beclin-1缺氧通路的關(guān)鍵蛋白p-AMPK,AMPK,p-m TOR,m TOR,p-p70S6K,p70S6K以及Hif-1α,BNIP3,Beclin-1,Bcl2的表達(dá)水平。結(jié)果:與對(duì)照組相比,MCT大鼠右室心肌LC3,LC3-II/LC3-I比值及于2,4,6周持續(xù)上調(diào)表達(dá),而P62則下調(diào)表達(dá);透射電鏡顯示右室心肌細(xì)胞內(nèi)自噬體持續(xù)增多;相反,對(duì)照組各時(shí)點(diǎn)亞組LC3,LC3-II/LC3-I比及P62差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,心肌細(xì)胞內(nèi)自噬體少見(jiàn)。此外,MCT及對(duì)照組大鼠的各時(shí)點(diǎn)亞組左室心肌LC3,LC3-II/LC3-I及P62差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。右室心肌LC3蛋白水平與增高的肺動(dòng)脈收縮壓呈顯著正相關(guān)(r2=0.626,P0.01)。與對(duì)照組相比,p-AMPK蛋白于2周至4周上調(diào)表達(dá),而在6周時(shí)下調(diào)表達(dá);相反,p-m TOR則表現(xiàn)為2周至4周下調(diào),而在6周時(shí)上調(diào)表達(dá);各時(shí)點(diǎn)AMPK,m TOR及p70S6K蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而,與對(duì)照組相比,BNIP3、Beclin-1蛋白于2周至4周呈較低水平表達(dá),而6周時(shí)顯著上調(diào),Hif-1α與BNIP3變化趨勢(shì)不完全一致,于4周達(dá)峰值,6周稍下降。此外,MCT大鼠右室心肌Bcl2于2周時(shí)達(dá)到峰值,4周至6周依次降低。對(duì)照組各時(shí)點(diǎn)亞組右室心肌相關(guān)蛋白表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:PAH右室心肌持續(xù)激活自噬與增高的肺動(dòng)脈收縮壓呈顯著正相關(guān)關(guān)系。AMPK/m TOR及BNIP3/Beclin-1缺氧相關(guān)自噬信號(hào)通路可能參與了PAH右室自噬調(diào)控;2周至4周自噬激活主要通過(guò)AMPK/m TOR通路,而6周時(shí)則主要為BNIP3/Beclin-1通路依賴,BNIP3的活化不完全受Hif-1α所調(diào)控。第三部分AMPK/m TOR及BNIP3/Beclin-1通路調(diào)控自噬對(duì)缺氧心肌細(xì)胞的影響目的:通過(guò)研究AMPK/m TOR和BNIP3/Beclin-1調(diào)控自噬對(duì)缺氧心肌細(xì)胞影響;結(jié)合第二部分研究,進(jìn)一步揭示不同通路激活自噬對(duì)PAH右室重構(gòu)的作用。方法:(1)將一組大鼠心肌細(xì)胞株H9C2細(xì)胞分為常氧組、缺氧組(2天)、缺氧+AMPK抑制劑(Compound C)組、缺氧+AMPK激活劑(AICAR)組共四亞組;western blot檢測(cè)心肌細(xì)胞p-AMPK,AMPK,p-m TOR,m TOR通路關(guān)鍵蛋白表達(dá);單丹磺酰尸胺(monodansylcadaverin,MDC)熒光染色觀察心肌自噬體,western blot檢測(cè)LC3蛋白表達(dá)水平;在bafilomycin A1處理缺氧及缺氧+AICAR心肌細(xì)胞的基礎(chǔ)上,再次通過(guò)MDC熒光染色觀察自噬體,western blot檢測(cè)LC3蛋白表達(dá)水平;WGA熒光染色顯示心肌細(xì)胞大小,RT-q PCR檢測(cè)心房鈉尿肽(Atrial natriuretic peptide,ANP)與B型腦鈉肽(Type B natriuretic peptide,BNP)的m RNA表達(dá);CCK8法檢測(cè)心肌細(xì)胞存活率;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡。將另一組心肌細(xì)胞分為缺氧組、缺氧+AICAR組、缺氧+AICAR+3-MA組;MDC熒光染色觀察心肌自噬小體,Western blot檢測(cè)LC3蛋白表達(dá)水平;CCK8法檢測(cè)心肌細(xì)胞存活率;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡。(2)將一組心肌細(xì)胞分為常氧組、缺氧組(4天)、陰性對(duì)照組,缺氧+BNIP3-RNAi干擾組,缺氧+LV-BNIP3過(guò)表達(dá)共五亞組;Western blot檢測(cè)心肌細(xì)胞BNIP3及Beclin-1通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平;MDC熒光染色檢測(cè)心肌細(xì)胞自噬小體,Western blot檢測(cè)LC3蛋白表達(dá)水平;CCK8法檢測(cè)心肌細(xì)胞存活率;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡。在bafilomycin A1處理缺氧及缺氧+LV-BNIP3過(guò)表達(dá)心肌細(xì)胞的基礎(chǔ)上,再次通過(guò)MDC熒光染色觀察自噬體,western blot檢測(cè)LC3蛋白表達(dá)水平。將另一組心肌細(xì)胞分為缺氧組、缺氧+陰性對(duì)照組、缺氧+LV-BNIP3過(guò)表達(dá)組、缺氧+BNIP3過(guò)表達(dá)+3-MA組;MDC熒光染色觀察心肌自噬小體,Western blot檢測(cè)LC3蛋白表達(dá)水平;CCK8法檢測(cè)心肌細(xì)胞存活率;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡。結(jié)果:(1)與常氧組相比,缺氧組p-AMPK/AMPK上調(diào)表達(dá),而p-m TOR/m TOR下調(diào)表達(dá);MDC熒光強(qiáng)度增高,LC3-II/LC3-I比值上調(diào)表達(dá);心肌細(xì)胞存活率下降,而凋亡率增高。與缺氧組相比,Compound C干預(yù)組p-AMPK/AMPK下調(diào)表達(dá),而p-m TOR/m TOR上調(diào)表達(dá);MDC熒光強(qiáng)度降低,LC3-II/LC3-I比值下調(diào)表達(dá);心肌細(xì)胞存活率降低;凋亡率顯著增高。相反,AICAR干預(yù)組p-AMPK/AMPK上調(diào)表達(dá),而p-m TOR/m TOR下調(diào);MDC熒光強(qiáng)度增強(qiáng),LC3-II/LC3-I比值增高;心肌細(xì)胞存活率增高;凋亡率顯著降低。各組心肌細(xì)胞大小及ANP、BNP m RNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)bafilomycin A1處理后,缺氧及缺氧+AICAR干預(yù)組心肌細(xì)胞MDC熒光強(qiáng)度及LC3-II/LC3-I顯著增加。與缺氧+AICAR組相比,缺氧+AICAR+3-MA組心肌細(xì)胞MDC熒光強(qiáng)度降低,LC3-II/LC3-I比值下調(diào)表達(dá);心肌細(xì)胞存活率降低;凋亡率顯著增高。(2)與常氧組相比,缺氧組BNIP3及Beclin-1上調(diào)表達(dá);MDC熒光強(qiáng)度增強(qiáng),LC3-II/LC3-I比值上調(diào)表達(dá),心肌細(xì)胞存活率下降,凋亡率增加。與缺氧組相比,BNIP3-RNAi干擾組的BNIP3及Beclin-1下調(diào)表達(dá),MDC熒光強(qiáng)度減低,LC3-II/LC3-I比值下調(diào)表達(dá);心肌細(xì)胞存活率增加,凋亡率降低;相反,LV-BNIP3過(guò)表達(dá)組BNIP3及Beclin-1上調(diào)表達(dá),MDC熒光強(qiáng)度增強(qiáng),LC3-II/LC3-I比值上調(diào)表達(dá);心肌細(xì)胞存活率降低,凋亡率增高。陰性對(duì)照組與缺氧培養(yǎng)組各檢測(cè)指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)bafilomycin A1處理后,缺氧及缺氧+LV-BNIP3過(guò)表達(dá)組心肌細(xì)胞MDC熒光強(qiáng)度及LC3-II/LC3-I顯著增加。與未經(jīng)3-MA處理缺氧+LV-BNIP3過(guò)表達(dá)組相比,經(jīng)3-MA處理的缺氧+LV-BNIP3過(guò)表達(dá)心肌細(xì)胞MDC熒光強(qiáng)度減低,LC3-II/LC3-I比值下調(diào)表達(dá);心肌細(xì)胞存活率增加;而凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:缺氧條件下,AMPK/m TOR通路通過(guò)自噬激活發(fā)揮促心肌細(xì)胞存活(包括凋亡抑制),而對(duì)心肌細(xì)胞大小無(wú)顯著影響;BNIP3/Beclin-1通路通過(guò)調(diào)控自噬水平促進(jìn)心肌細(xì)胞死亡。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R544.1

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