本文關(guān)鍵詞：HMGB1參與EAM心肌纖維化的機(jī)制及對(duì)固有免疫細(xì)胞功能的影響　出處：《江蘇大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：背景高遷移率族蛋白l(HMGB1),是一種重要的炎癥介質(zhì),可由免疫細(xì)胞和一些非免疫細(xì)胞主動(dòng)分泌,或受損及壞死細(xì)胞被動(dòng)釋放。HMGB1與許多炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系,諸如：超敏反應(yīng)、自身免疫性疾病、感染性疾病等。本實(shí)驗(yàn)室已有的研究數(shù)據(jù)表明,HMGB1在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎(EAM)小鼠心臟組織或血清中表達(dá)上調(diào)；封閉HMGB1可以改善EAM后期的心肌纖維化。然而,迄今為止,沒有數(shù)據(jù)能夠直接表明HMGB1與心肌纖維化的關(guān)系。據(jù)此,本研究旨在探討：①上調(diào)HMGB1有無可能直接導(dǎo)致EAM的心肌纖維化；②在EAM,心肌成纖維細(xì)胞／肌纖維母細(xì)胞能否分泌HMGB1,可否作為另一高水平]HMGB1源頭；③HMGB1阻斷能否有效地防止EAM后期的心肌纖維化。此外,對(duì)可能參與自身免疫性心肌炎的免疫失調(diào)因素進(jìn)行了初步探討,包括Toll樣受體(TLR)及Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3(Runx3)/CpG ODN對(duì)細(xì)胞增殖的影響,及其與IMGB1分泌或釋放的關(guān)系；妊娠相關(guān)疾病患者血清HMGB1的水平及作用。方法本研究所采用的試驗(yàn)方法包括：流式細(xì)胞分析、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)、Western印跡、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、細(xì)胞培養(yǎng)和增殖試驗(yàn)(MTT)、細(xì)胞遷移試驗(yàn)以及組織病理學(xué)分析等。1.實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎小鼠模型的建立BALB/c小鼠,6-8周齡,由揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購買并在江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。本研究使用的所有動(dòng)物試驗(yàn)過程,均按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理使用指南(美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院出版no.85-23,1996修訂)操作。小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎模型的誘導(dǎo)方法簡(jiǎn)介如下：于0天和7天接種含有100ggMyHC-α(MyHC-α614-629; Ac-SLKLMATLFSTYASAD-OH)的1:1PBS/CFA乳化物。在接種的第54天,誘模小鼠經(jīng)戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后頸椎脫位處死,并取相關(guān)檢材進(jìn)行分析。所有實(shí)驗(yàn)均獲江蘇大學(xué)研究與教學(xué)用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)委員會(huì)批準(zhǔn)。2.流式細(xì)胞儀分析研究選用了十五例慢性糖尿病患者、十四例妊娠糖尿病患者和十七例先兆子癇患者,年齡從19歲到41歲不等。經(jīng)免疫熒光染色后,應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析計(jì)數(shù)外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中Thl7細(xì)胞的比率。3.熒光定量]PCR (qRT-PCR)應(yīng)用RT-qPCR方法,分別檢鋇TLR2、TLR4、TLR9、RAGE、HMGB1、Ⅰ/Ⅲ膠原(Col1/3)、骨橋蛋白(OPN)、Hlx、Runx3、MMP1和TIMP1/2的mRNA表達(dá)水平。4.免疫印跡Western blot檢測(cè)心肌成纖維細(xì)胞/肌纖維母細(xì)胞中膠原I、膠原]Ⅲ、P-PKC-β、p-EIK-1/2、f-erk-1/2和HMGB1的蛋白表達(dá)水平；同法檢測(cè)有或無CpG ODN誘導(dǎo)的A549細(xì)胞中Runx3的蛋白表達(dá)水平。5. ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)用于定量檢測(cè)慢性糖尿病患者、妊娠糖尿病和先兆子癇患者血漿中的干擾素γ、IL-17、IL-1β和高遷移率族蛋白l(HMGB1)的水平。6.細(xì)胞培養(yǎng)與增殖試驗(yàn)根據(jù)參考文獻(xiàn)[31,32],取1-2周齡BALB/c小鼠,分離心臟成纖維細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM(含10%胎牛血清)被用于培養(yǎng)心肌成纖維細(xì)胞。用MTT法檢測(cè)心肌成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞的增殖。同時(shí),MTT法也用于分析CpG ODN對(duì)Runx3基因特異性siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。7.遷移試驗(yàn)遷移試驗(yàn)選用6孑LTranswell板與8-1m-pore-size聚碳酸酯過濾器。在有或無外源性HMGB1存在的條件下,分析心臟成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的遷移作用。8.組織病理學(xué)分析HE染色方法用于觀察實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎模型的組織病理學(xué)改變；用Sirius red染色法檢測(cè)心肌纖維化；免疫熒光染色分析在脂多糖刺激下,心肌成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞分泌HMGB1的能力。9.統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)均顯示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。Student's test或雙向方差分析用于評(píng)價(jià)組間差異的顯著性。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism 5和／或SPSS11.5軟件,P值0.05被認(rèn)為有意義。結(jié)果我們的研究結(jié)果表明：1.HMGB1可能直接導(dǎo)致心肌膠原沉積,這與PKCβ/ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)；此外,在外部應(yīng)力下,心肌成纖維細(xì)胞／肌纖維母細(xì)胞主動(dòng)分泌HMGB1;心臟成纖維細(xì)胞／肌纖維母細(xì)胞分泌的HMGB1,可通過PKCβ激活以自分泌方式導(dǎo)致心肌纖維化。在EAM小鼠,阻斷HMGB1能有效地改善心臟的纖維化。2.在外部壓力下,HMGB1可從心臟成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的細(xì)胞核穿梭至胞質(zhì)。本研究還表明,除免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞和壞死細(xì)胞外,同樣作為心臟重要組成的心臟成纖維細(xì)胞/肌纖維母細(xì)胞,是否在EAM時(shí)也充當(dāng)HMGB1的重要來源。3.在妊娠相關(guān)疾病,升高的血漿HMGB1水平很有可能導(dǎo)致ILC的分化和隨后生產(chǎn)的IL-17。此外,在包括先兆子癇和妊娠糖尿病在內(nèi)的妊娠相關(guān)性疾病中,增高的IL-17表達(dá)水平可能產(chǎn)生于ILC3,并在失控性炎癥應(yīng)答時(shí)構(gòu)成胎兒流產(chǎn)的威脅。4. CpG ODN可顯著抑制A549細(xì)胞的增殖。在CpG ODN刺激A549細(xì)胞,Runx3的表達(dá)在mRNA和蛋白水平均增多。CpG ODN對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制能力,在]Runx3基因siRNA轉(zhuǎn)染后受到明顯地控制。這一結(jié)果表明,TLR9活化和Runx3基因表達(dá)之間存在著密切的關(guān)系,也可能與HMGB1分泌有關(guān),需要進(jìn)一步證實(shí)。結(jié)論本研究表明,HMGB1可通過PKCβ/ERK1/2-依賴的信號(hào)通路直接導(dǎo)致心肌膠原沉積；在外界應(yīng)力下,心肌成纖維細(xì)胞/肌纖維母細(xì)胞分泌的HMGB1,通過激活PKCβ以自分泌的方式導(dǎo)致心臟的纖維化；封閉HMGB1都能有效地改善EAM小鼠的心肌纖維化。此外,在妊娠相關(guān)疾病的血漿中,HMGB1增高并可導(dǎo)致ILC的分化和隨后產(chǎn)生IL-17、TLR9活化與RUNX3基因表達(dá),參與某些細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控,并推測(cè)可能與IMGB1的分泌相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R542.2

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本文編號(hào)：1330015