發(fā)布時間：2017-12-24 17:37

  本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)錄因子HOXB7對多發(fā)性骨髓瘤發(fā)生、發(fā)展的影響及其機制的研究　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：背景:多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種中老年人多見的疾病,而且它是目前認(rèn)為無法治愈的一種血液系統(tǒng)腫瘤,一般表現(xiàn)為惡性漿細(xì)胞的增生,同時還伴有骨痛、乏力等其他非特異性的臨床癥狀,早期一般不易被發(fā)現(xiàn),它一般可以侵犯骨骼,出現(xiàn)骨質(zhì)的損害,同時也可以出現(xiàn)其他器官的損傷,其他臟器也會不同程度的累及,如甲狀腺、消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng),如果侵犯到心臟及肺臟時,甚至可以侵犯到心包或胸腔等組織,從而進一步引起全身多臟器損害,進一步引起代謝的紊亂,以及免疫功能的異常[1]�，F(xiàn)階段,我們主要采取化學(xué)治療和造血干細(xì)胞的移植的方法治療多發(fā)性骨髓瘤。雖然目前有各種新藥的出現(xiàn),緩解率及生存率有所提高,但最終會病情復(fù)發(fā),但對于患者來說患者生存質(zhì)量有待提高,長期生存不理想,同時由于病情反復(fù)、進展導(dǎo)致治療效果差,同時腫瘤的易侵襲性,加之多發(fā)耐藥這一普遍現(xiàn)象的存在,同時還有其他因素等原因,迫使我們要更深入的研究多發(fā)性骨髓瘤的新的致病基因及發(fā)病機制,來提升患者的治療療效。難治導(dǎo)致的治療失敗需要我們尋求新的細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路及致病因素以找到新的治療靶點,因為腫瘤極容易復(fù)發(fā)及侵襲性的特點,更需要找到影響浸潤、進展的致病基因及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子。故目前我們研究的焦點在防止腫瘤進展、浸潤上。目前大多數(shù)研究認(rèn)為多發(fā)性骨髓瘤與血管新生有關(guān),它的發(fā)生、發(fā)展及髓外浸潤與相關(guān)的細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路失活有關(guān),同時與異常的細(xì)胞生物遺傳學(xué)有關(guān),既往研究表明多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生是一種多因素的事件,這些因素相互關(guān)聯(lián),相互影響及作用促進瘤細(xì)胞的生成及腫瘤的進程。多發(fā)性骨髓瘤的明確的致病因素目前需要進一步深入探討,在研究的過程當(dāng)值,發(fā)現(xiàn)了許多基因的高表達(dá)或者是某些特定基因的低表達(dá),這些基因的異常表達(dá)可能與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生有密切關(guān)系。資料顯示,有一些細(xì)胞因子的分泌會直接刺激骨髓瘤細(xì)胞生長及增殖,這些細(xì)胞因子常常位于瘤細(xì)胞中或者微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞中,目前認(rèn)為與多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病關(guān)系較密切的細(xì)胞因子有:血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs),如MMP-2與MMP-9,同時還發(fā)現(xiàn)以下細(xì)胞因子對瘤細(xì)胞有促進增殖及浸潤的作用,包括:成纖維生長因子(b FGF)、白介素-8、血管生成素-1、骨橋蛋白(OPN)等。這些細(xì)胞因子可能受到某些細(xì)胞信號的刺激后,會分泌有所增加,同時與某些特定的癌基因相互作用,它們均有促進血管新生作用[2]。國內(nèi)外的一些研究已經(jīng)證實HOXB7基因可特異性誘導(dǎo)b FGF、GROa、VEGF等血管生長因子表達(dá)水平上調(diào),激活PI3K/Akt信號傳導(dǎo)途徑,抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡,然后進一步促進腫瘤血管生成、腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移。HOXB7基因促進腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及腫瘤細(xì)胞的血管生成等作用,在多種實體腫瘤細(xì)胞中已經(jīng)得到證實,而其在造血系統(tǒng)腫瘤及造血細(xì)胞中的作用尚不清楚,關(guān)于HOXB7是否與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生以及骨髓瘤的進展、浸潤相關(guān)的資料較少,故是我們所研究的重點。因此,本文研究了轉(zhuǎn)錄因子HOXB7在不同臨床分期的多發(fā)性骨髓瘤患者中的作用,同時檢測了一系列相關(guān)基因的表達(dá),為了更深入的明確HOXB7因子的作用,并了解HOXB7因子是否與多發(fā)性骨髓瘤發(fā)生、發(fā)展及浸潤相關(guān)。同時通過HOXB7-si RNA瞬時轉(zhuǎn)染多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞,使HOXB7因子的表達(dá)降低,從而對其他相關(guān)基因進行分子生物學(xué)的檢測,比較轉(zhuǎn)染前后表達(dá)的變化,明確多發(fā)性骨髓瘤致病基因,并為進一步治療多發(fā)性骨髓瘤提供理論基礎(chǔ),從而闡述HOXB7基因可能與骨髓瘤的進展密切相關(guān)。國內(nèi)外關(guān)于HOXB7與多發(fā)性骨髓瘤的關(guān)系方面,這一領(lǐng)域的研究相對較少,在此研究中,我們發(fā)現(xiàn)HOXB7基因在一部分多發(fā)性骨髓瘤患者中有表達(dá),同時存在表達(dá)的患者容易出現(xiàn)病情進展及髓外浸潤,具有潛在的促血管新生及促進細(xì)胞增殖的作用,對多發(fā)性骨髓瘤的病情進展有促進作用。通過si RNA轉(zhuǎn)染多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞,使HOXB7基因下調(diào),檢測其他相關(guān)基因的表達(dá)情況,進一步說明它在多發(fā)性骨髓瘤中的作用,尋找治療多發(fā)性骨髓瘤的新的靶點。把研究分為三部分:第一部分轉(zhuǎn)錄因子HOXB7在多發(fā)性骨髓瘤患者中的臨床意義目的:應(yīng)用實時熒光定量PCR的方法檢測多發(fā)性骨髓瘤患者中HOXB7m RNA及其應(yīng)用Westernblot的方法檢測其蛋白水平,闡述它在多發(fā)性骨髓瘤中的作用機制,并且純化分離多發(fā)性骨髓瘤患者的骨髓單個核細(xì)胞,并分析MM患者中HOXB7因子在不同的多發(fā)性骨髓瘤臨床階段的情況,明確HOXB7與骨髓瘤的進展及髓外浸潤的關(guān)系。方法:采用CD138抗體把MM細(xì)胞進行分離純化臨床收集的49例MM患者骨髓單個核細(xì)胞,并同時取患者骨髓組織及骨髓上清液,采用20例缺鐵性貧血患者作為對照組,將患者按Durie-Salmon分期和是否伴有髓外浸潤進行分組,進行分析。應(yīng)用免疫組化的方法進行骨髓組織的化學(xué)染色,并用實時熒光定量PCR(FQ-PCR)法檢測HOXB7的表達(dá),Western blot法測定其蛋白表達(dá)水平,用ELISA的方法檢測骨髓上清液中的蛋白含量結(jié)果:1 49例MM患者中,其中有35例MM患者表達(dá)HOXB7 m RNA,其表達(dá)水平為(0.466±0.148),20例對照組的表達(dá)水平為(0.179±0.061),二者相比有顯著差異(P0.01)。我們應(yīng)用Durie-Salmon分期,把MM患者分為兩組。Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ期。其中Ⅰ+Ⅱ期MM患者組21例,HOXB7 m RNA表達(dá)水平為(0.372±0.131)。Ⅲ期MM患者組28例,HOXB7 m RNA表達(dá)水平為(0.561±0.099),并把Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ期MM患者組分別與對照組做比較,結(jié)果顯示有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),而把Ⅰ+Ⅱ期MM患者組和Ⅲ期MM患者組進行比較后,結(jié)果顯示差異顯著(P=0.018;P0.05)。在所有MM患者的標(biāo)本中行WNT5A m RNA的檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)WNT5A m RNA的表達(dá)水平為:(0.588±0.225),對照組的表達(dá)水平為(0.192±0.011),Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ期MM患者組的表達(dá)水平分別為(0.426±0.133),(0.751±0.176),兩者相比后顯示,差異顯著(P=0.005;P0.01),與對照組比較后結(jié)果顯示P0.01,差異顯著,有統(tǒng)計學(xué)意義。在所有MM患者的標(biāo)本中行VEGFA,MMP2,b FGF,MMP9,Cyclin D1m RNA的表達(dá)水平的檢測,Ⅰ+Ⅱ期患者的表達(dá)水平分別為(0.826±0.327),(1.726±0.462),(1.026±0.215),(0.735±0.109),(1.726±0.319),Ⅲ期MM患者組為(1.204±0.662),(2.336±0.421),(2.273±0.406),(2.261±0.520),(1.836±0.402),與對照組比較(P0.05),把Ⅰ+Ⅱ期MM患者組和Ⅲ期MM患者組進行比較后,結(jié)果顯示差異顯著(P0.01)。2在III期MM患者中,其中伴有髓外浸潤的患者有9例,不伴有髓外浸潤的患者有19例,其中伴有髓外浸潤的患者的HOXB7m RNA的表達(dá)為(0.751±0.176),不伴有髓外浸潤的HOXB7m RNA患者表達(dá)為(0.639±0.051),經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)分析顯示差異顯著(P0.05),WNT5A m RNA在伴有髓外浸潤的患者的表達(dá)為(0.896±0.105),不伴有髓外浸潤的患者表達(dá)為(0.605±0.056)。二者與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義,(P0.01)。二者相比,統(tǒng)計學(xué)分析有顯著差異(P0.05)。3根據(jù)NCCN指南里治療多發(fā)性骨髓瘤中,多發(fā)性骨髓瘤患者的治療的療效標(biāo)準(zhǔn),把多發(fā)性骨髓瘤患者分為newly diagnosed,s CR,CR,VGPR,PR,SD,progressive disease,clinical relapse,and relapse from CR.對MM患者行Western blot的檢測。Newly diagnosed(初治)MM患者20例,s CR MM患者5例,CR MM患者3例,VGPR MM患者1例,PR MM患者2例,SD MM患者5例,共計16例病情穩(wěn)定的患者,progressive disease MM患者3例,clinical relapse MM患者6例,relapse from CR MM患者4例,共計13例復(fù)發(fā)及病情進展的MM患者。在49例MM患者選取Newly diagnosed、(s CR及CR、VGPR、PR、SD)MM患者、(progressive disease,clinical relapse,and relapse from CR)MM患者各6例,對照組選取10例,其中10例對照組HOXB7蛋白平均表達(dá)水平為(0.075±0.026),18例MM患者的HOXB7蛋白的平均表達(dá)水平為(0.268±0.127),其中Newly diagnosed組HOXB7蛋白的平均表達(dá)水平為(0.278±0.050),(s CR及CR、VGPR、PR、SD)組MM患者與(progressive disease,clinical relapse,and relapse from CR)MM患者組HOXB7蛋白的平均表達(dá)水平為分別為(0.199±0.039),(0.327±0.131)。初治的MM患者與復(fù)發(fā)、病情進展的MM患者,分別與病情穩(wěn)定的MM患者相比較,結(jié)果顯示有差異顯著(P0.01)。而把初治MM患者與復(fù)發(fā)及病情進展的MM患者相比較后,結(jié)果顯示無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。初治患者組、復(fù)發(fā)及病情進展的MM患者分別與對照組比較,結(jié)果有顯著差異(P0.01)。在選取的這些患者中其中Ⅰ+Ⅱ期MM患者組6例,HOXB7平均表達(dá)水平為(0.216±0.047)。Ⅲ期MM患者組12例,HOXB7蛋白平均表達(dá)水平為(0.320±0.114),并把Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ期MM患者組分別與對照組做比較,結(jié)果顯示有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而把Ⅰ+Ⅱ期MM患者組和Ⅲ期MM患者組進行比較后,結(jié)果顯示差異顯著(P0.01)。WNT5A蛋白在Ⅰ+Ⅱ期MM患者的平均表達(dá)水平為(0.398±0.136),Ⅲ期MM患者組平均表達(dá)水平為(0.549±0.142),與對照組表達(dá)水平有顯著差異P0.05,二者比較有統(tǒng)計學(xué)意義P0.01。4對Newly diagnosed、(s CR及CR、VGPR、PR、SD)MM患者、(progressive disease,clinical relapse,and relapse from CR)MM患者各6例行WNT5a,VEGFA,MMP-2,β-catenin,MMP-9,Cyclin D1,survivin蛋白的檢測,其中MMP-2、β-catenin、VEGFA、MMP-9蛋白在Newly diagnosed和(progressive disease,clinical relapse,and relapse from CR)MM患者中的平均表達(dá)水平明顯高于(s CR及CR、VGPR、PR、SD)MM患者中的平均表達(dá)水平,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析,差異顯著(P0.01),與對照組比較,有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。5我們按照多發(fā)性骨髓瘤的患者是否伴有髓外浸潤,將所有的多發(fā)性骨髓瘤患者分為兩組。把12例III期MM患者中4例無髓外浸潤的MM患者和8例伴髓外浸潤的MM患者檢測HOXB7蛋白水平,平均表達(dá)水平分別為(0.265±0.085)和(0.389±0.051),分別與對照組比較,差異顯著,有統(tǒng)計學(xué)意義,二者之間比較,有明顯差異(P0.05)。WNT5A蛋白在無髓外浸潤的MM患者中的平均蛋白水平為(0.441±0.075),伴髓外浸潤的MM患者的WNT5A蛋白平均表達(dá)水平(0.673±0.0.185),分別與對照組比較,差異顯著,有統(tǒng)計學(xué)意義,二者之間比較,有明顯差異(P0.01)。二者經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)分析顯示(P0.01),差異顯著。6免疫組化染色HOXB7、VEGFA、β-catenin、WNT5a蛋白(1)免疫組化染色HOXB7蛋白結(jié)果:在I+II期患者中,有1例顯示低表達(dá),陽性率為5%,有2例高表達(dá),陽性率為10%,在III期患者中,有5例呈現(xiàn)低表達(dá)水平,10例患者為高表達(dá),陽性率分別為,17.9%,35.7%,兩組MM患者經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析有明顯差異,(P0.01)。III期MM患者的陽性率明顯高于I+II期患者。在20例對照組中病例中有1例表達(dá)陽性,陽性率為5%,與對照組比較存在明顯差異(P0.05)。(2)免疫組化染色VEGFA蛋白結(jié)果:在I+II期患者中,有3例顯示低表達(dá),陽性率為14.2%,有4例高表達(dá),陽性率為16%,在III期患者中,有7例呈現(xiàn)低表達(dá)水平,11例患者為高表達(dá),陽性率分別為,25%,39.3%,兩組MM患者經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析有明顯差異,(P0.05)。III期MM患者的陽性率明顯高于I+II期患者。在20例對照組中病例中有2例表達(dá)陽性,陽性率為10%,與對照組比較存在明顯差異(P0.05)。(3)免疫組化染色β-catenin蛋白結(jié)果:在I+II期患者中,有1例顯示低表達(dá),陽性率為5%,沒有高表達(dá),陽性率為0%,在III期患者中,有3例呈現(xiàn)低表達(dá)水平,5例患者為高表達(dá),陽性率分別為10.7%,17.9%,兩組MM患者經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析有明顯差異,(P0.01)。III期MM患者的陽性率明顯高于I+II期患者。對照組中無陽性表達(dá),與對照組比較存在明顯差異(P0.05)。(4)免疫組化染色WNT5a蛋白結(jié)果:在I+II期患者中,有3例顯示低表達(dá),陽性率為14.2%,高表達(dá)患者有4例,陽性率為16%,在III期患者中,有7例呈現(xiàn)低表達(dá)水平,11例患者為高表達(dá),陽性率分別為25%,39.3%,兩組MM患者經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析有明顯差異,(P0.01)。III期MM患者的陽性率明顯高于I+II期患者。對照組中2例陽性表達(dá),與對照組比較存在明顯差異(P0.05)。應(yīng)用Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示,HOXB7蛋白與WNT5A蛋白呈正相關(guān),HOXB7蛋白與VEGFA蛋白呈正相關(guān)。7用ELISA的方法檢測骨髓上清液在所有MM患者中,檢測骨髓上清中IL-6、VEGF、MMP-2、MMP-9Cyclin D1、β-catenin蛋白含量,結(jié)果顯示蛋白平均含量明顯高于對照組,兩者進行統(tǒng)計學(xué)分析,差異顯著(P0.05)。初治與復(fù)發(fā)進展MM患者IL-6蛋白含量明顯高于病情穩(wěn)定MM患者,進行統(tǒng)計學(xué)分析顯示差異顯著(P0.05);結(jié)論:HOXB7基因及蛋白與WNT5a基因與蛋白在多發(fā)性骨髓瘤患者的不同分期中表達(dá)水平不同,III期的MM患者的表達(dá)較高。初治MM患者、復(fù)發(fā)及病情進展MM患者的表達(dá)水平與病情穩(wěn)定患者比較有差異,有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。二者在在髓外浸潤的患者中表達(dá)高于無髓外浸潤的MM患者,考慮MM患者中如果存在HOXB7與WNT5a表達(dá),可能容易出現(xiàn)髓外浸潤或者進展,故其表達(dá)水平可能與MM患者疾病的進展有關(guān),并促進血管新生及髓外浸潤。此外在高表達(dá)的HOXB7與WNT5a的患者中,伴隨其他促血管新生及促細(xì)胞增殖的相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)。第二部分轉(zhuǎn)錄因子HOXB7促進多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226增殖及應(yīng)用小干擾RNA后對RPMI8226細(xì)胞的影響目的:應(yīng)用瞬時轉(zhuǎn)染的方法,采用HOXB7-si RNA轉(zhuǎn)染RPMI8226細(xì)胞,使HOXB7基因表達(dá)下降,進一步探討HOXB7基因?qū)PMI8226細(xì)胞增殖影響的機制,明確HOXB7基因在RPMI8226細(xì)胞株中的作用。方法:采用瞬時轉(zhuǎn)染的方法,把特異的HOXB7-si RNA進行轉(zhuǎn)染至RPMI 8226細(xì)胞,抑制細(xì)胞內(nèi)HOXB7基因的表達(dá)。應(yīng)用熒光定量PCR(FQ-PCR)方法檢測HOXB7 m RNA水平以及WNT5A m RNA,MMP-2m RNA,MMP-9 m RNA,β-catenin m RNA表達(dá)水平變化。并采用Western Blot的方法檢測上述蛋白水平。轉(zhuǎn)染后使用MTT的方法檢測小干擾RNA對細(xì)胞活力的影響;同時應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測小干擾RNA對細(xì)胞周期的影響;結(jié)果:1 HOXB7-si RNA在轉(zhuǎn)染RPMI8226細(xì)胞株48h后,HOXB7 m RNA表達(dá)水平明顯受到抑制,HOXB7-si RNA轉(zhuǎn)染組的表達(dá)水平為0.329±0.047,negative control-si RNA轉(zhuǎn)染組為0.985±0.136,HOXB7-si RNA轉(zhuǎn)染組的表達(dá)水平分別與陰性對照組和空白對照相比,差異顯著,有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。2用Western blot法檢測HOXB7蛋白表達(dá)水平,轉(zhuǎn)染24小時,HOXB7-si RNA轉(zhuǎn)染組的蛋白表達(dá)水平為0.068±0.002,negative control-si RNA轉(zhuǎn)染組的蛋白表達(dá)水平為0.619±0.118,HOXB7-si RNA轉(zhuǎn)染組的表達(dá)水平分別與陰性對照組和空白對照相比,存在明顯差異,有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。3 HOXB7-si RNA轉(zhuǎn)染RPMI8226細(xì)胞后RPMI8226細(xì)胞增殖影響MTT法檢測RPMI8226細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的生長情況。通過繪制生長曲線,細(xì)胞轉(zhuǎn)染HOXB7-si RNA48h,細(xì)胞的生長抑制較明顯,negative control-si RNA轉(zhuǎn)染組和HOXB7-si RNA轉(zhuǎn)染組OD 490值比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。4 HOXB7-si RNA轉(zhuǎn)染RPMI8226細(xì)胞后細(xì)胞周期的變化。細(xì)胞周期分析顯示HOXB7-si RNA轉(zhuǎn)染RPMI8226細(xì)胞48h后,細(xì)胞阻止于G2期,處于G0/G1期細(xì)胞比例降低,G2/M期和S期細(xì)胞比例升高,凋亡峰顯示凋亡的細(xì)胞比例增加。5 HOXB7-si RNA轉(zhuǎn)染RPMI8226細(xì)胞后48h,未轉(zhuǎn)染組、陰性對照轉(zhuǎn)染組、HOXB7-si RNA組,HOXB7 m RNA相對表達(dá)水平分別為1.058±0.341;1.128±0.315;0.142±0.045,negative control-si RNA組和HOXB7-si RNA組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。MMP-2 m RNA相對表達(dá)水平分別為2.606±0.521;1.858±0.186;0.882±0.353(P0.01)。MMP-9 m RNA相對表達(dá)水平分別為1.896±0.653;1.025±0.276;0.457±0.068;(P0.05)。WNT5a m RNA相對表達(dá)水平分別為:1.016±0.195;1.002±0.206;0.507±0.026(P0.01)。β-catenin m RNA相對表達(dá)水平分別1.012±0.205;1.006±0.179;0.682±0.351(P0.01)。negative control-si RNA和HOXB7-si RNA二組相比,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)6 HOXB7-si RNA轉(zhuǎn)染RPMI8226細(xì)胞后48h,未轉(zhuǎn)染組、NS-si RNA組、HOXB7si RNA組,HOXB7蛋白相對表達(dá)水平分別為0.858±0.204,0.619±0.118和0.068±0.021,negative control-si RNA組與HOXB7-si RNA組相比有顯著性差異(P0.01)。MMP-2蛋白相對表達(dá)水平分別為1.018±0.216;0.734±0.159;0.283±0.114(P0.01)。MMP-9蛋白相對表達(dá)水平分別為1.236±0.253;1.022±0.259;0.453±0.098;(P0.05)。WNT5a蛋白相對表達(dá)水平分別為:1.016±0.129;0.947±0.221;0.207±0.028(P0.01)。β-catenin蛋白相對表達(dá)水平分別1.154±0.205;1.006±0.179;0.682±0.351(P0.01)negative control-si RNA和HOXB7-si RNA二組相比,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。結(jié)論:通過小干擾RNA瞬時轉(zhuǎn)染HOXB7基因后,明顯抑制RPMI8226細(xì)胞增殖,而瘤細(xì)胞凋亡增加,HOXB7表達(dá)水平降低后,WNT5A,MMP-2,MMP-9,β-catenin的表達(dá)也降低,可能與HOXB7表達(dá)水平降低,并進一步引起凋亡相關(guān)基因分子以及是否與WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路信號分子異常有關(guān)。第三部分人參皂苷Rg3(Rg3)抑制RPMI8226細(xì)胞株和U266細(xì)胞株增殖的研究目的:研究人參皂苷Rg3對RPMI8226細(xì)胞株的增殖影響,并為臨床治療多發(fā)性骨髓瘤提供理論證據(jù),并闡述人參皂苷Rg3發(fā)揮抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的致病機制。方法:應(yīng)用CCK-8的方法檢測人參皂苷Rg3對RPMI8226細(xì)胞株和U266細(xì)胞株增殖抑制作用;采用流式細(xì)胞儀檢測人參皂苷Rg3對細(xì)胞周期分布;熒光定量PCR(FQ-PCR)和Western Blot的方法,檢測HOXB7m RNA,bcl-2 m RNA,bax m RNA,caspase-9 m RNA,,caspase-8m RNA和caspase-3 m RNA及蛋白水平的變化結(jié)果:1 CCK-8的方法檢測人參皂苷Rg3對人類多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株增殖抑制的影響。人參皂苷Rg3對U266細(xì)胞株和RPMI8226細(xì)胞株的抑制作用存在時間-劑量-依賴性,人參皂苷Rg3在80μg/ml作用于U266細(xì)胞48h后,達(dá)到最大抑制水平。在一半最大抑制濃度(IC50)值為47.5 mg/mll。人參皂苷Rg3在RPMI8226(IC50=36.8μg/ml)細(xì)胞株中比U266細(xì)胞有更強的細(xì)胞增殖抑制作用。2流式細(xì)胞儀檢測人參皂苷Rg3對細(xì)胞周期的影響。用20、40和80μg/ml的Rg3分別處理U266細(xì)胞和RPMI8226細(xì)胞株,結(jié)果顯示在G1期細(xì)胞群百分比增加,而S期的細(xì)胞群比例下降。然而,Rg3對G2/M期沒有影響。3 Western Blot分析顯示經(jīng)過Rg3處理U266細(xì)胞后,HOXB7蛋白的表達(dá)有所降低,bcl-2蛋白的表達(dá)有所降低,bax蛋白的表達(dá)有所升高,并降低了bcl-2/bax的比率。同時檢測細(xì)胞凋亡-相關(guān)的蛋白質(zhì)。Western Blot分析顯示Rg3增加了caspase-9,caspase-8和caspase-3蛋白表達(dá)。結(jié)論:人參皂苷Rg3能夠明顯抑制U266、RPMI8226的細(xì)胞活性與增殖作用,出現(xiàn)有時間-劑量-依賴性。降低了HOXB7的水平,同時增加了凋亡蛋白的表達(dá),并且可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白-依賴激酶途徑導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G1期�？紤]Rg3可能促進多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的凋亡,使Bcl-2/Bax蛋白的平衡失調(diào),故Rg3能夠有效地抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,可以作為有效的治療多發(fā)性骨髓瘤的藥物。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R733.3

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Ginsenoside Rg_3 inhibit hepatocellular carcinoma growth via intrinsic apoptotic pathway[J];World Journal of Gastroenterology;2011年31期

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本文編號：1329341