本文關鍵詞：可溶性血管內皮生長因子受體-1在老年小鼠缺血性血管再生中的作用及其機制及心力衰竭患者血清中組織蛋白酶K濃度的臨床意義　出處：《延邊大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：第一部分:可溶性血管內皮生長因子受體sFlt-1在老年小鼠下肢缺血性血管再生中的作用及其機制隨著社會的發(fā)展,生活水平日益提高,老齡化程度不斷加深,老年性下肢缺血性疾病的發(fā)病率也逐年上升。研究表明老化可削弱哺乳動物體內血管再生能力,從而導致組織再生能力的下降。在各種不同的哺乳動物中,與年齡相關的特征是血管生長因子失活及血管再生能力下降,表現為為血管內皮功能障礙和骨髓(Bone-Marrow,BM)及外周血內皮祖細胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)的數量減少和內在功能減退,血管內皮細胞凋亡與增殖的失衡,細胞外微環(huán)境變化(生長因子缺乏、炎癥因子和氧化應激增高等)等。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)于 1989 年首次發(fā)現,是一種能特異的作用于血管內皮細胞的生長因子,具有促血管生成等活性的因子。VEGF家族成員包括胎盤生長因子(PIGF)、VEGFA-F及其受體VEGFR1-3及Neuropilins,其中VEGF受體特異性地分布于血管內皮細胞等,VEGF通過與其受體的結合而發(fā)揮促進血管新生和增強血管通透性的生理作用。VEGFR-1不僅在內皮細胞中表達,在造血干細胞、造骨細胞、胎盤滋養(yǎng)層細胞以及單核-巨噬細胞中也有表達。VEGFR-1與VEGF A-B-和PIGF有高度親和力。人體和動物的研究已被證實體內生成的可溶性VEGFR-1(sFlt-1)由VEGFR-1的細胞外部分構成,發(fā)揮抑制VEGF的作用,VEGFR-1在血管新生期及缺氧時表達上調。另有研究表明妊娠婦女伴有先兆子癇患者的血清中sFlt-1的水平升高,而PIGF和VEGF的水平反而降低。眾所周知,生物缺氧/缺血導致促血管生長因子的增加,如VEGF表達增加及其受體激活(包括Flt1和Flk1),誘導各種血管細胞的活動(包括誘導血管細胞增殖、遷移、侵襲)增加,從已有的血管中生成新的小管樣結構,使血管管腔進一步成熟。越來越多的研究表明,在各種病理條件下血管VEGF及其VEGFR剪接可引起抗血管再生作用�？扇苄匝軆绕どL因子受體1(SolubleVEGFR1,sFlt1)被稱為血管VEGF的拮抗劑,是一種缺乏細胞質和跨膜結構域的VEGFR剪接變體。最近的實驗和臨床研究得出了許多重要的結果,細胞培養(yǎng)中sFlt1通過結合并占據VEGFR從干擾VEGF占據和隨之增長的信號轉導。臨床研究發(fā)現,在代謝紊亂和冠心病患者中血漿sFlt1水平的改變與其疾病的治療與血管再生相關。最近的血管生物學研究表明,在人和動物的下肢缺血性疾病中,Wnt5/SC35的激活抑制血管再生,此外在骨髓細胞中,非正規(guī)的Wnt-sFlt1信號通路對血管再生起負性調控作用。老年下肢缺血性血管再生能力的減退是復雜的慢性的病理生理過程,然而其分子機制尚未完全闡明。目的:探討老年小鼠的血管再生能力下降的分子機制,為臨床治療老年下肢缺血性疾病的新靶點提供實驗依據。方法:建立下肢缺血小鼠模型,利用超聲多普勒檢測小鼠下肢血流,采用免疫組化觀察缺血組織中巨噬細胞、粒細胞的表達和毛細血管密度,采用免疫印跡法、PCR和ELISA方法檢測血液中sFlt1水平、觀察Wnt/SC35表達及VEGFR2/Akt信號通路蛋白表達水平;采用雙重免疫熒光法觀察分泌VEGF和sFlt1的細胞;明膠酶譜法觀察MMP-2/-9活性;利用流式細胞術觀察衰老對骨髓源EPC水平;利用siRNA-Wnt5轉染法觀察Wnt5a蛋白的表達;培養(yǎng)HUVECs細胞后利用Diff-Quik染色,用BZ-Ⅱ分析儀計算細胞數量,使用CellTiter 96AO試劑盒測定細胞遷移、侵襲和增殖率;采用5β-半乳糖苷酶(βGal)染色法觀察HUVECs衰老表型。結果1.老化對缺血性血管再生的影響與年輕小鼠相比,老年小鼠缺血/非缺血血流量比值的恢復持續(xù)受阻,非缺血和缺血骨骼肌均毛細血管密度減低。2.老化對sFlt1表達及下游信號傳導通路的影響與年輕小鼠相比,老年小鼠缺血骨骼肌中總sFlt1基因水平顯著增加,sFlt1陽性染色信號(即剪接變體的sFlt1(77kDa)和sFlt114(82kDa))表達明顯增加,Flt-1主要表達于浸潤到巨噬細胞,p-VEGFR2和p-Akt蛋白表達降低。3.老化對Wnt5a/11和SC35表達的影響與年輕小鼠相比,在老齡小鼠缺血性骨骼肌中Wnt5a、Wnt5amRNA及SC35蛋白表達均增高,并且Wnt11基因水平也增高,而其他Wnt家族成員(Wnt3和3a、Wnt5b,WNT7a 和 7b、Wnt8a,Wnt9b,Wnt1Oa 和 10b),表達無顯著差異。4.老化促進缺血骨骼肌炎癥反應與年輕小鼠相比,老年小鼠缺血肌肉中Galectin-3蛋白及和TLR2蛋白表達水平增加,白細胞和巨噬細胞數量增加,MMP-2和MMP-9的Gelatinolytic活性水平顯著增高。5.老化損害祖細胞的內在功能與年輕的老鼠相比,老年小鼠外周血c-Kit +/CD31 +祖細胞數量顯著減少。老化明顯減弱VEGF-A誘導的c-Kit+的遷移、侵襲和增殖率。6.老年小鼠骨毮源性CD11b +細胞分泌sFlt1未加熱老化的骨髓源性CD1 1b+細胞(ACD11b+Cs)培養(yǎng)上清液(ACD1 1b+CM)抑制HUVEC的增殖,而未加熱年輕的CD11b+細胞(YCD11b+Cs)培養(yǎng)上清液(YCD11b+CM)刺激HUVEC的增殖;YCD11b+CM增強VEGF-A誘導的細胞增殖,而在ACD11b+CM中無增殖效果;與YCD11b+Cs相比,缺氧刺激骨髓ACD11b+Cs的sFlt1蛋白合成分泌,而缺氧對年輕骨髓c-Kit+細胞(Yc-Kit+Cs)和老年骨髓c-Kit+細胞(Ac-Kit+Cs)的sFlt1蛋白合成無影響;YCD1 1b+CM刺激VEGF誘導的HUVEC形成小管腔結構,而ACD11b+CM則抑制形成小管腔結構。7.Wnt5a/SC35調控sFlt1釋放及其下游VEGFR2/Akt信號通路Wnt5a不僅抑制其本身mRNA合成,而且抑制其下游SC35蛋白表達及缺氧誘導的 sFlt1 釋放;與 siCont-濃縮 ACD11b+CM 相比,siWnt5a-濃縮 ACD11b+CM明顯促進 VEGF 誘導 HUVECs 的 VEGFR2 和 Akt 磷酸化;siWnt5a-ACD1 1b+CM明顯改善VEGF誘導的HUVEC形成小管樣結構;與不加熱ACD11b+CM相比,加熱siWnt5aACD11b+CM抑制VEGF誘導的年輕EPC-樣c-Kit+細胞增殖,具有EPC小管樣結構的刺激作用。結論1.老化可引起抑制血管再生能力。2.sFlt1的表達水平增高可能是引起VEGFR2/Akt通路失活的原因,在降低老年動物缺血誘導的血管再生中發(fā)揮決定性作用。3.Wnt5a/SC35表達水平與老化有密切相關,表明老化可誘發(fā)缺血性缺血時過度的炎癥反應。4.骨髓CD11b+巨噬細胞可能是在缺血缺氧的應激條件下sFlt1表達的主要細胞來源,抑制老年小鼠的抗血管生成能力。5.Wnt5a/SC35調控老化缺血骨骼肌中巨噬細胞合成及分泌sFlt1,通過減弱VEGFR2/Akt信號通路,抑制老年小鼠的血管再生能力。老化抑制缺血性血管再生的機制可能是在缺血缺氧應激條件下激活巨噬細胞Wnt5a/SC35軸依賴的sFlt1合成及分泌,從而降低ECs和EPCs中VEGFR2/Akt信號通路的失活而導致老化缺血性血管再生能力減退。第二部分:心力衰竭患者血清中組織蛋白酶K濃度的臨床意義半胱氨酰組織蛋白酶(Cysteinyl cathepsins)是半胱氨酸的木瓜蛋白酶家族成員之一,是蛋白酶超級家族。在人類中,已經識別確定了 11種該家族成員,即cathepsinsB,C,F,H,K,L,O,V,W,和X。所有成員共享一個守恒:即與半胱氨酸、組氨酸和門冬氨酸殘留物形成活躍的三維立體的囊狀結構。組織蛋白酶的一級結構包括信號肽,前導肽,重鏈及輕鏈。正常情況下,組織蛋白酶在核糖體以帶有N端信號肽的前體形式存在,在信號肽的引導下,定位到高爾基體,甘露糖殘基被修飾為6-磷酸甘露糖(mannose-6 reside phosphorylation,M6P)。修飾后,通過6-磷酸甘露糖受體依賴性或非依賴性通路轉移至內質網和溶酶體,逐步被多種蛋白水解酶(如胃蛋白酶、嗜中性彈性蛋白酶、組織蛋白酶D)激活或自身激活,并以鈣離子依賴的"胞吐"(exocytosis)方式分泌到細胞外,參與溶酶體蛋白質的重新利用。近年來的研究發(fā)現,組織蛋白酶在細胞內和細胞外的血管生成和心血管疾病中扮演著非傳統的角色。不僅如此,最近專家們研究還發(fā)現,組織蛋白酶在溶酶體以外的細胞內和細胞外參與信號傳遞和調控細胞功能,并在血管生成及心血管重構過程中扮演著非傳統的角色。組織蛋白酶K(CathepsinK,CatK)是木瓜蛋白酶家族的一員,初期發(fā)現在巨噬細胞和破骨細胞分泌,隨后發(fā)現在血管動脈硬化病變部位血管平滑肌細胞及炎癥細胞的高表達等。除能降解膠原蛋白外,還能降解彈力蛋白及纖維蛋白,并在骨質重塑以及血管再生和動脈硬化形成及發(fā)展中起極其重要作用。已有研究證明在衰竭的心臟中,組織蛋白酶的表達發(fā)生變化,提示組織蛋白酶參與這一病理變化。Hua等研究中發(fā)現高脂飲食相關受損心肌細胞收縮功能和細胞內Ca2+處理,是通過組織蛋白酶K基因敲除來調節(jié)。此外,組織蛋白酶K抑制,可以使棕櫚酸誘導的受損的心肌收縮力恢復,這表明組織蛋白酶K直接調節(jié)心肌收縮力。研究者們一直認為上調肌漿網鈣泵(SERCA2a)的表達,可以降低心臟肥大。而Hua等發(fā)現了高脂喂養(yǎng)之后SERCA2a和phospholamban(受磷蛋白)表達上調,更重要的是組織蛋白酶K敲除之后導致受磷蛋白與SERCA2a表達比例提高,盡管這些變化的機制目前尚不明確。在組織蛋白酶K敲除的小鼠心肌細胞中靜息Ca2+濃度增加和SERCA2a的表達上調,可以部分地解釋組織蛋白酶K敲除所致心肌收縮力提高的機制。2013年,作者們在研究中有個突出的發(fā)現,老鼠缺乏組織蛋白酶K基因有抵抗壓力負荷誘發(fā)的心臟肥厚、纖維化及收縮異常的現象,在分子水平上組織蛋白酶K敲除減緩壓力負荷誘發(fā)的心臟肥厚。在心肌細胞,壓力超負荷抑制了心肌細胞收縮功能,隨同降低了靜息的Ca2+水平和延遲了Ca2+的清除,中斷了細胞內鈣離子動態(tài)平衡,其中調解效果是通過組織蛋白酶K的敲除來完成。組織蛋白酶K敲除未能改變壓力超負荷之后的小鼠的血壓,提示組織蛋白酶K敲除后的收益為心臟特異性。研究中還發(fā)現上調組織蛋白酶K表達的小鼠左心室組織受到壓力負荷之后,更快的出現心臟衰竭。由此可見,組織蛋白酶K在心臟肥厚中起著致病、促進心臟肥厚等作用。最近,本課題組在臨床研究中發(fā)現了在心房纖顫和冠心病患者血漿中CatK增高,但尚無慢性心衰與血漿中的CatK的濃度相關性的研究。目的探討慢性心衰患者血漿中Cat K濃度變化及其臨床意義,試圖找出CHF患者血液各項指標中有用的非侵入性生物標志物。方法選擇為2012年3月至2014年3月就診于延邊大學附屬醫(yī)院的慢性心衰(CHF)失代償患者共計134例,所有入選患者的標準均為心功能NYHA分級Ⅱ-Ⅳ級并伴有射血分數降低的CHF患者(包括有心肌梗死病史,原發(fā)性高血壓或特發(fā)性擴張型心肌病的CHF患者)。CHF患者接受標準藥物治療包括:利尿劑,正性肌力藥物(如地高辛),他汀類藥物,β-受體阻滯劑,血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)和血管緊張素I型受體拮抗劑(ARB),將全部患者以左室射血分數(LVEF)值不同分為低 EF 值組(EF40%,n=44)和高 EF 值組(EF≥40%,n=90)。全部患者取靜脈血液使用酶聯免疫檢測吸附試驗(ELISA)檢測血漿CatK濃度、N 末端腦鈉肽(NT-proBNP)、肌鈣蛋白、LDL、HDL、hs-CRP 和 HbAic水平采用SONOS2500的超聲心動圖診斷儀測定左室后壁厚度(LVPWT)、室間隔厚度(IVST)、左室舒張末期內徑(LVDd),左心室收縮末期內徑(LVSD)及左室射血分數(LVEF),使用M-型法測量左房內徑(LAD)。結果1.兩組患者的年齡和體重指數無顯著性差異。2.線性回歸結果分析表明血漿CatK水平與LVEF(r =-0.4,P0.001)呈負相關,與LVDd(r = 0.2,P0.01)和LVDs(r = 0.3,P0.001)水平呈正相關,血漿CatK水平和LAD(r = 0.3,P0.01)也呈正相關。3.134例患者中心功能Ⅱ級的患者17例、心功能Ⅲ級的患者47例、心功能IV級的患者70例。LVDd和LVDS的測定值分別為55.9±14.5mm和48.7±11.9 mm,提示左心室擴張。IVST和LVPWT的測定值分別為9.3 ± 1.5 mm和12.5±2.1 mm。LVEF 降低至 41.9±8.3%。血漿 BNP 及 CatK 濃度分別為 4024±4026 pg/ml和51.6±16.6 ng/ml。在低LVEF值組患者中腦血管疾病,或接受血管修復術的發(fā)病率更高,表明低LVEF值組患者更需要接受醛固酮受體拮抗劑、利尿劑和地高辛這些傳統藥物的綜合治療;兩組IVST或LVPWT值無明顯統計學差異。4.在單因素回歸分析中年齡、性別、高血壓、LVDd、LAD、和CatK水平與CHF顯著相關。而體重指數,糖尿病,超敏C反應蛋白和肌鈣蛋白I與CHF是無相關性。多元回歸分析結果表明高血壓(比值比[OR]4.11;95%可信區(qū)間[CI]1.08-15.69;P0.05)、LAD(比值比[OR]1.13;95%CI 1.01-1.25;P0.05)、左心室舒張末期內徑(比值比[OR]1.20;95%CI,1.05-1.37;P0.01)和CatK(比值比[OR]0.90;95%CI 0.84-0.95;P0.01)水平均與 CHF 顯著相關。結論1.血漿CatK水平升高可以作為CHF 一種新的生物標志物;2.血漿CatK濃度可作為對CHF患者的心肌重構與功能障礙程度的一種無創(chuàng)的監(jiān)測指標。
【學位授予單位】：延邊大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R54

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