本文關(guān)鍵詞：流體剪應(yīng)力—材料表面化學(xué)共刺激對(duì)成骨細(xì)胞早期行為的影響　出處：《重慶大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：因交通事故、運(yùn)動(dòng)損傷、老齡化、生殖缺陷或疾病等導(dǎo)致每年有大量人群的骨組織受損,甚至缺失。組織工程為有效修復(fù)受損骨組織提供了可能。種子細(xì)胞和支架是組織工程的兩個(gè)核心組成部分。成骨細(xì)胞是骨組織工程典型的種子細(xì)胞,支架作為一種人工胞外基質(zhì),在為成骨細(xì)胞提供物理支撐的同時(shí)也為成骨細(xì)胞提供生長(zhǎng)的微環(huán)境。支架材料的結(jié)構(gòu)(包括化學(xué)結(jié)構(gòu)、表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)以及空間幾何結(jié)構(gòu))調(diào)控成骨細(xì)胞的生命行為。同時(shí),成骨細(xì)胞作為一種力敏感細(xì)胞,還需要接受合適的力學(xué)刺激才可能形成具有正常生理功能的骨組織。因此,支架和力學(xué)刺激共同構(gòu)成了成骨細(xì)胞體外生化反應(yīng)器的重要組成部分,二者共同調(diào)控成骨細(xì)胞行為,決定骨組織工程的成敗。研究支架結(jié)構(gòu)和力學(xué)因素共刺激對(duì)成骨細(xì)胞行為的影響對(duì)于設(shè)計(jì)和制造有利于形成功能性骨組織的支架材料和生化反應(yīng)器有重要的指導(dǎo)意義。關(guān)于單獨(dú)的支架結(jié)構(gòu)或單獨(dú)的力學(xué)刺激對(duì)成骨細(xì)胞行為的影響及其影響機(jī)制的研究報(bào)道已很多,但迄今卻鮮見關(guān)于支架結(jié)構(gòu)和力學(xué)刺激的共同作用對(duì)成骨細(xì)胞行為影響及其影響機(jī)制的報(bào)道�？紤]到支架表面化學(xué)是最重要的支架結(jié)構(gòu)信息之一,流體剪應(yīng)力(FSS)是在體骨組織中最主要的力學(xué)刺激,本論文考查了支架表面化學(xué)和FSS共刺激對(duì)成骨細(xì)胞早期行為(FSS敏感因子ATP、NO、PGE2釋放、早期增殖和早期分化)的影響及影響機(jī)制。黏著斑形成和細(xì)胞骨架形態(tài)都參與了材料表面化學(xué)和FSS影響成骨細(xì)胞行為的調(diào)控機(jī)制。因此,本論文還考查了表面化學(xué)-FSS共刺激之后黏著斑和細(xì)胞骨架形態(tài)變化及其與細(xì)胞早期行為之間的關(guān)系,并驗(yàn)證了有關(guān)共刺激機(jī)制的核心假設(shè):黏著斑和細(xì)胞骨架是材料表面化學(xué)和流體剪應(yīng)力共刺激調(diào)控成骨細(xì)胞行為的關(guān)鍵結(jié)構(gòu),材料表面化學(xué)通過調(diào)控成骨細(xì)胞黏著斑和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)來調(diào)控成骨細(xì)胞對(duì)流體剪應(yīng)力的響應(yīng)。主要的研究?jī)?nèi)容和所取得的結(jié)果如下:(1)利用硅烷化自組裝技術(shù)在組織培養(yǎng)載玻片表面(Glass)構(gòu)建OH、NH2和CH3表面,水接觸角和X射線光電子能譜(XPS)分析表明已成功制得CH3、OH、NH2表面;構(gòu)建了基于平行板流動(dòng)腔的FSS加載裝置;將成骨細(xì)胞接種在不同化學(xué)表面后置于平行板流動(dòng)腔中,施加不同大小的FSS,從而成功構(gòu)建了表面化學(xué)-FSS共刺激平臺(tái),為后續(xù)共刺激研究奠定了基礎(chǔ)。(2)考查了單獨(dú)表面化學(xué)刺激對(duì)成骨細(xì)胞黏著斑形成與F-actin骨架形態(tài)的影響,以及對(duì)細(xì)胞早期增殖潛能(PI)、堿性磷酸酶(ALP)活性和化學(xué)因子(ATP、NO、PGE2)釋放的影響,相關(guān)結(jié)果為后續(xù)共刺激研究提供對(duì)照。結(jié)果表明,NH2刺激使成骨細(xì)胞F-actin纖維束粗壯、黏著斑數(shù)量多且尺寸大,而CH3和OH刺激使成骨細(xì)胞F-actin組織和黏著斑結(jié)構(gòu)疏松,呈現(xiàn)化學(xué)依賴性NH2(Glass)OH≈CH3;與Glass表面相比,NH2表面明顯促進(jìn)而CH3和OH表面明顯抑制成骨細(xì)胞早期增殖和分化;表面化學(xué)對(duì)ATP和NO的釋放沒有顯著影響,但對(duì)PGE2釋放有影響。(3)考查了表面化學(xué)與不同大小FSS共刺激對(duì)成骨細(xì)胞化學(xué)因子(ATP、NO和PGE2)釋放、增殖潛能、ALP活性,和細(xì)胞粘附的影響。①低流體剪應(yīng)力(5 dynes/cm2,低于骨組織生理FSS,記為L(zhǎng)FSS)與材料表面化學(xué)共同刺激:與單純的表面化學(xué)刺激相比,LFSS明顯提高CH3和OH表面成骨細(xì)胞的化學(xué)因子釋放和增殖潛力,而對(duì)Glass和NH2表面的成骨細(xì)胞沒有顯著影響;LFSS明顯提高了CH3和OH表面成骨細(xì)胞的取向性或細(xì)胞鋪展?fàn)顟B(tài),而對(duì)NH2和Glass表面成骨細(xì)胞沒有影響。結(jié)合LFSS刺激前(單獨(dú)表面化學(xué)刺激)各化學(xué)表面上成骨細(xì)胞的F-actin骨架和黏著斑狀態(tài),提示其可能機(jī)制是表面化學(xué)刺激通過影響成骨細(xì)胞黏著斑形成和F-actin骨架形態(tài),導(dǎo)致CH3和OH表面上成骨細(xì)胞對(duì)LFSS的敏感性高,而NH2表面上成骨細(xì)胞對(duì)LFSS的敏感性低。就FSS敏感性而言,在LFSS環(huán)境中,CH3和OH是合適的骨組織工程支架表面化學(xué)結(jié)構(gòu)。②生理流體剪應(yīng)力(12 dynes/cm2,最佳骨組織生理FSS,記為PFSS)與材料表面化學(xué)共同刺激:與單純的表面化學(xué)刺激相比,PFSS明顯提高所有化學(xué)表面成骨細(xì)胞的化學(xué)因子釋放和早期增殖,且具有明顯的表面化學(xué)依賴性NH2-PFSS(Glass-PFSS)OH-PFSS≈CH3-PFSS;PFSS使所有化學(xué)表面成骨細(xì)胞的取向或形態(tài)都發(fā)生了改變。結(jié)合PFSS刺激前(單獨(dú)表面化學(xué)刺激)各化學(xué)表面上成骨細(xì)胞的F-actin骨架和黏著斑狀態(tài),提示細(xì)胞黏著斑和F-actin骨架在表面化學(xué)-PFSS共刺激調(diào)控成骨細(xì)胞行為中有重要作用。在PFSS環(huán)境中,NH2是最合適的骨組織工程支架表面結(jié)構(gòu)。③高流體剪應(yīng)力(20 dynes/cm2,高于最佳骨組織生理FSS,記為HFSS)與材料表面化學(xué)共同刺激:CH3和OH表面成骨細(xì)胞不能承受HFSS刺激,發(fā)生明顯的脫落和細(xì)胞膜破裂現(xiàn)象,而NH2表面細(xì)胞能夠承受HFSS的刺激,并沿HFSS發(fā)生明顯的細(xì)胞取向。與單純的表面化學(xué)刺激相比,HFSS明顯促進(jìn)NH2表面成骨細(xì)胞的化學(xué)因子釋放,并顯著提高細(xì)胞增殖潛能。上述結(jié)果提示,在HFSS環(huán)境中,CH3、OH或CH3/OH混合結(jié)構(gòu)不適合用作骨組織工程支架的表面化學(xué)結(jié)構(gòu),而NH2是合適的表面化學(xué)結(jié)構(gòu)。(4)系統(tǒng)分析了不同大小FSS(LFSS、PFSS、HFSS)與材料表面化學(xué)共刺激對(duì)成骨細(xì)胞早期行為的影響,并結(jié)合黏著斑抑制和F-actin細(xì)胞骨架阻斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果解析了表面化學(xué)-FSS共刺激對(duì)成骨細(xì)胞行為的調(diào)控機(jī)制。①通過引入FSS響應(yīng)閥值(細(xì)胞能感受到的最低FSS)、破壞閥值(使細(xì)胞脫落或細(xì)胞膜破裂的最低FSS)和最佳閥值(使細(xì)胞具有最佳響應(yīng)的FSS)這三個(gè)概念,系統(tǒng)分析了不同大小FSS(LFSS、PFSS、HFSS)與表面化學(xué)共刺激對(duì)成骨細(xì)胞早期行為的影響。與Glass相比,CH3和OH表面明顯下調(diào)而NH2明顯上調(diào)成骨細(xì)胞的FSS響應(yīng)閥值和破壞閥值。CH3和OH表面細(xì)胞的FSS響應(yīng)閥值低于5 dynes/cm2,破壞閥值介于12-20 dynes/cm2;而NH2表面細(xì)胞的響應(yīng)閥值介于5-12 dynes/cm2,破壞閥值高于20 dynes/cm2。FSS響應(yīng)閥值和破壞閥值對(duì)表面化學(xué)的依賴性與不同化學(xué)表面上成骨細(xì)胞的黏著斑和F-actin骨架狀態(tài)密切相關(guān)。②采用RGDS抑制黏著斑形成后再施加PFSS刺激,各化學(xué)表面成骨細(xì)胞的PGE2釋放大幅度降低,且不再具有表面化學(xué)依賴性;ATP和NO釋放有一定程度的降低,提示FSS介導(dǎo)的PGE2釋放依賴于黏著斑,這與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)是一致的。③采用細(xì)胞松弛素B阻斷F-actin后施加PFSS刺激,各化學(xué)表面成骨細(xì)胞的NO釋放量大幅度降低,且不再具有表面化學(xué)依賴性;ATP和PGE2釋放量有一定程度的降低,提示NO釋放依賴于完整的細(xì)胞骨架,這與文獻(xiàn)報(bào)道是一致的。④同時(shí)抑制黏著斑形成和阻斷F-actin后施加PFSS,所有化學(xué)表面成骨細(xì)胞幾乎都不再釋放ATP、NO和PGE2。⑤當(dāng)成骨細(xì)胞黏著斑和F-actin同時(shí)被損以后,表面化學(xué)不再影響細(xì)胞對(duì)PFSS的響應(yīng),細(xì)胞對(duì)PFSS也不再產(chǎn)生響應(yīng)。結(jié)合前述表面化學(xué)和不同大小FSS共刺激對(duì)成骨細(xì)胞行為的影響,可以得出共刺激對(duì)成骨細(xì)胞行為的調(diào)控機(jī)制:表面化學(xué)通過調(diào)控成骨細(xì)胞黏著斑和F-actin細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu),調(diào)控成骨細(xì)胞對(duì)FSS的敏感性(FSS響應(yīng)閥值)和耐受能力(FSS破壞閥值),繼而調(diào)控成骨細(xì)胞對(duì)表面化學(xué)-FSS共刺激的響應(yīng)。針對(duì)不同的FSS大小,需結(jié)合成骨細(xì)胞的敏感性和耐受能力選擇合適的支架表面化學(xué),為成骨細(xì)胞提供最優(yōu)的生化反應(yīng)器,實(shí)現(xiàn)功能性骨組織的快速形成。
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R318.08;R687

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1319448