本文關(guān)鍵詞：貝氏柯克斯體表面蛋白和T細胞表位的鑒定及免疫原性研究　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：貝氏柯克斯體(Coxiella burnetii)是一種革蘭陰性、專性胞內(nèi)寄生小球桿菌,為重要的人獸共患病——Q熱(Q fever)的病原菌。貝氏柯克斯體感染人,可引起急性Q熱和慢性Q熱,貝氏柯克斯體感染家畜,主要引起牛、羊孕畜流產(chǎn),而感染家畜也為人群Q熱最主要的傳染源。急性Q熱用抗生素治療有效,但未及時治療而發(fā)展為慢性Q熱后則難以治愈。疫苗接種是預(yù)防人、畜貝氏柯克斯體感染的最有效措施。雖然接種滅活貝氏柯克斯體全菌疫苗能夠誘導(dǎo)機體有效對抗貝氏柯克斯體感染,但免疫后引起機體嚴重副反應(yīng)使得其難以在人群中推廣使用。目前,國內(nèi)外學(xué)者力圖采用先進的分子生物學(xué)技術(shù)對貝氏柯克斯體抗原分子進行研究,以期發(fā)現(xiàn)保護性抗原分子去研發(fā)安全有效的Q熱分子疫苗。近十多年來,Q熱分子疫苗的研究僅僅局限于少數(shù)幾種貝氏柯克斯體外膜蛋白,研究證明它們的特異性保護效果有限且明顯弱于滅活貝氏柯克斯體全菌抗原。我們采用生物素-鏈親和素親和層析從貝氏柯克斯體菌體裂解液中提取表面蛋白,采用等電聚焦和SDS-PAGE電泳分離提取的表面蛋白,采用電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜鑒定分離的表面蛋白,結(jié)果發(fā)現(xiàn)37種貝氏柯克斯體表面蛋白。生物信息學(xué)將37種表面蛋白分為11個功能類型;8種蛋白具有經(jīng)典的N端信號肽或非經(jīng)典的分泌信號,提示可能為分泌蛋白;10種蛋白可能定位于細胞外膜,4種蛋白可能定位于非細胞質(zhì)(包括外膜、內(nèi)膜、周質(zhì)),6種蛋白亞細胞定位未知。采用基因克隆技術(shù)成功在大腸埃希菌表達30個貝氏柯克斯體重組表面蛋白,再用鎳離子親和層析從表達菌中分離純化重組表面蛋白,并將其點制一張貝氏柯克斯體表面蛋白芯片。用貝氏柯克斯體感染小鼠血清和Q熱患者血清分析表面蛋白芯片,結(jié)果有23個表面蛋白與半數(shù)以上的貝氏柯克斯體感染小鼠4周血清反應(yīng)陽性,其中15個表面蛋白與半數(shù)以上的Q熱患者血清反應(yīng)陽性并且具有較好的血清學(xué)特異性。該結(jié)果提示這15個主要血清反應(yīng)表面蛋白可以作為Q熱血清學(xué)檢測的候選診斷抗原和研發(fā)Q熱亞單位疫苗的候選免疫原。通過T細胞表位在線預(yù)測軟件分析貝氏柯克斯體7個表面蛋白的H2-Ab限制型CD4~+T細胞表位,預(yù)測出121條15氨基酸長的CD4~+T細胞表位肽,并人工合成這些表位肽。將這7個重組表面蛋白分別免疫C57BL/6小鼠,再從免疫小鼠脾臟中分離CD4~+T細胞,然后將121條CD4~+T細胞表位肽分別與相應(yīng)重組表面蛋白免疫小鼠CD4~+T細胞共孵育,最后用酶聯(lián)斑點(ELISPOT)法分析每條表位肽誘導(dǎo)CD4~+T細胞的IFN-γ分泌水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中34條表位肽能夠誘導(dǎo)CD4~+T細胞分泌較高水平的IFN-γ。剔除氨基酸序列高度相似的表位肽,最后選擇其中22條為有效貝氏柯克斯體CD4~+T細胞表位肽。將這22條CD4~+T細胞表位肽分別體外刺激貝氏柯克斯體全菌抗原免疫C57BL/6小鼠的CD4~+T細胞,最后選出源自7個不同蛋白抗原、可誘導(dǎo)CD4~+T細胞分泌高水平IFN-γ的7條CD4~+T細胞表位肽。將這7條CD4~+T細胞表位肽單獨或混合刺激貝氏柯克斯體全菌抗原免疫C57BL/6小鼠的CD4~+T細胞,用流式細胞術(shù)分析CD4~+T細胞的IFN-γ和TNF-α表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們都能誘導(dǎo)較高比例CD4~+T細胞表達IFN-γ,其中3條表位肽也能誘導(dǎo)較高比例CD4~+T細胞表達TNF-α。此外,ELISPOT法分析發(fā)現(xiàn)這7條表位肽混合誘導(dǎo)CD4~+T細胞分泌IFN-γ的水平顯著高于單條表位肽,提示多條CD4~+T細胞表位肽混合激活CD4~+T細胞的效能顯著好于單條表位肽。將這7條CD4~+T細胞表位肽單獨或混合免疫C57BL/6小鼠,免疫后用貝氏柯克斯體攻毒評價其免疫保護效能。結(jié)果多條CD4~+T細胞表位肽混合免疫小鼠的脾重和貝氏柯克斯體載量均顯著低于單條表位肽免疫小鼠,證明多條CD4~+T細胞表位肽混合免疫保護效果顯著好于單條表位肽。通過T表位在線預(yù)測軟件分析貝氏柯克斯體的24個分泌蛋白和6個外膜蛋白的CD8~+T細胞表位,預(yù)測出157條H2-Kb、Db限制型9氨基酸長的CD8~+T細胞表位,并人工合成這些表位肽。將這157條CD8~+T細胞表位肽體外分別刺激貝氏柯克斯體感染C57BL/6小鼠的脾臟CD8~+T細胞,用ELISPOT分析每條表位肽誘導(dǎo)CD8~+T細胞的IFN-γ分泌水平。結(jié)果顯示29條表位肽均能誘導(dǎo)CD8~+T細胞分泌較高水平IFN-γ。其中22條表位肽的源蛋白為分泌蛋白,它們并非主要血清反應(yīng)蛋白。將這29條CD8~+T細胞表位肽分別刺激貝氏柯克斯體感染C57BL/6小鼠的CD8~+T細胞,流式細胞術(shù)分析顯示所有表位肽均能單獨誘導(dǎo)CD8~+T細胞表達IFN-γ,表達IFN-γ的CD8~+T細胞比例為0.44%~3.78%。將29條CD8~+T細胞表位肽基因串聯(lián)后連接至原核表達質(zhì)粒,將重組表達質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入單核細胞增生性李斯特桿菌疫苗菌(LM),構(gòu)建表達貝氏柯克斯體CD8~+T細胞表位肽的疫苗菌(LM-Cb)。用LM-Cb免疫C57BL/6小鼠,免疫后用貝氏柯克斯體攻擊免疫小鼠評價其免疫保護效能。結(jié)果LM-Cb免疫小鼠的脾重和貝氏柯克斯體載量均顯著地低于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌免疫小鼠或非免疫小鼠,證明貝氏柯克斯體CD8~+T細胞表位肽在LM-Cb中表達并誘導(dǎo)機體產(chǎn)生有效抗貝氏柯克斯體感染特異性免疫。綜上所述,我們分離、鑒定了37個貝氏柯克斯體表面蛋白,制備了30個貝氏柯克斯體重組表面蛋白并用其構(gòu)建貝氏柯克斯體表面蛋白芯片。用貝氏柯克斯體感染血清分析表面蛋白芯片,發(fā)現(xiàn)15個血清學(xué)反應(yīng)陽性且有良好血清學(xué)特異性的表面蛋白。計算機軟件分析貝氏柯克斯體外膜蛋白和分泌蛋白的氨基酸序列,預(yù)測并人工合成121條貝氏柯克斯體CD4~+T細胞表位肽和157條CD8~+T細胞表位肽,篩選出能夠激活相應(yīng)T細胞的CD4~+T細胞表位肽7條和CD8~+T細胞表位肽29條。研究進一步證明7條CD4~+T細胞表位肽混合激活CD4~+T細胞和29條CD8~+T細胞表位肽混合激活CD8~+T細胞的能力均顯著高于單條表位肽。將7條貝氏柯克斯體CD4~+T細胞表位肽單獨或混合免疫小鼠,再用貝氏柯克斯體攻擊免疫小鼠評價免疫保護效能,結(jié)果7條CD4~+T細胞表位肽混合免疫小鼠的貝氏柯克斯體載量顯著低于單條表位肽免疫小鼠。將29條貝氏柯克斯體CD8~+T細胞表位肽基因串聯(lián)后插入原核表達質(zhì)粒,將重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化李斯特菌免疫小鼠,結(jié)果表達CD8~+T細胞表位肽的疫苗菌免疫小鼠的貝氏柯克斯體載量顯著低于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌免疫。這些結(jié)果證明多條貝氏柯克斯體CD4~+T細胞表位肽或CD8~+T細胞表位肽聯(lián)合免疫能夠顯著增強機體特異性免疫應(yīng)答、有效對抗貝氏柯克斯體感染。我們的研究結(jié)果為Q熱血清學(xué)診斷試劑和Q熱分子疫苗的研制奠定了良好的理論與工作基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R392

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