本文關(guān)鍵詞：水環(huán)境中產(chǎn)ESBL腸桿菌耐藥質(zhì)粒在小鼠腸道內(nèi)水平轉(zhuǎn)移的分子機(jī)理　出處：《山東農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：合理使用抗生素能夠治療人類和動(dòng)物的感染性疾病,然而臨床中濫用和過度使用抗生素加劇了耐藥菌的出現(xiàn),甚至“超級(jí)細(xì)菌”的產(chǎn)生。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum beta-lactamases,ESBLs)主要是質(zhì)粒編碼的一類酶,能夠水解青霉素類、頭孢菌素類和氨曲南等抗生素,但不能水解頭霉素類(如頭孢西丁、頭孢替坦)或碳青霉烯類,可被克拉維酸、舒巴坦和他唑巴坦所抑制。全球流行的ESBLs主要包括SHV型、TEM型和CTX-M型。CTX-M型是目前最主要的β-內(nèi)酰胺酶類型。ESBLs主要在腸桿菌中發(fā)現(xiàn),腸桿菌是人和動(dòng)物腸道內(nèi)正常菌群,也是院內(nèi)和社區(qū)感染的重要病原體。人和動(dòng)物源的耐藥菌通過排放最終進(jìn)入到水環(huán)境中,其耐藥基因可能在水環(huán)境的細(xì)菌之間進(jìn)一步擴(kuò)散。水被認(rèn)為是耐藥基因重要的存儲(chǔ)庫(kù)。因此,一旦產(chǎn)ESBL腸桿菌通過污染的食物或飲用水進(jìn)入到人和動(dòng)物腸道內(nèi),很可能導(dǎo)致耐藥基因在人和動(dòng)物體內(nèi)傳播,甚至造成嚴(yán)重的感染。質(zhì)粒在腸桿菌之間具有潛在的轉(zhuǎn)移能力,很可能導(dǎo)致超級(jí)毒力或耐藥菌株出現(xiàn),在耐藥性的進(jìn)化和散播過程中起著重要的作用,但至今其轉(zhuǎn)移機(jī)制尚不明確。為了了解不同水環(huán)境中產(chǎn)ESBL腸桿菌的流行情況及其來源,以及攜帶ESBLs的耐藥質(zhì)粒在小鼠腸道內(nèi)水平轉(zhuǎn)移的分子機(jī)理,我們開展了以下研究。1.泰安農(nóng)村井水中產(chǎn)ESBL腸桿菌的流行及特點(diǎn)為了解泰安農(nóng)村井水中產(chǎn)ESBL腸桿菌的流行及特點(diǎn)。從4/100(4%)個(gè)采樣井中,共分離到10株產(chǎn)ESBL腸桿菌,包括9株大腸桿菌和1株肺炎克雷伯菌。ESBL基因型結(jié)果顯示9株菌為CTX-M-15,1株菌為CTX-M-27。5/8株CTX-M-15產(chǎn)ESBL大腸桿菌屬于ST10,在人糞便中經(jīng)常檢測(cè)到。值得注意的是,僅有1株CTX-M-27型大腸桿菌的多位點(diǎn)序列分型屬于B2:131(ST131),可能與人類和動(dòng)物的嚴(yán)重感染有關(guān)。2.館陶地區(qū)農(nóng)村蓄水池中產(chǎn)ESBL腸桿菌的多重耐藥性對(duì)館陶地區(qū)農(nóng)村蓄水池中產(chǎn)ESBL腸桿菌進(jìn)行分離并分析其特點(diǎn)。采集的30個(gè)蓄水池中,有5個(gè)(16.7%)分離檢測(cè)到產(chǎn)ESBL腸桿菌。本研究中分離到66株ESBL表型陽(yáng)性的非重復(fù)性菌株。菌種鑒定結(jié)果為42株為大腸桿菌,17株為肺炎克雷伯菌,4株植生拉烏爾菌、3株陰溝腸桿菌。20株菌含有單一的bla基因,包括CTX-M型(17株)、TEM(2株)和SHV(1株);46株菌同時(shí)含有兩種或三種bla基因。所有產(chǎn)ESBL腸桿菌均表現(xiàn)多重耐藥性。這些結(jié)果表明館陶地區(qū)的農(nóng)村蓄水池已被產(chǎn)ESBL腸桿菌嚴(yán)重污染。3.泰安黃前水庫(kù)中產(chǎn)esbl耐熱腸桿菌的耐藥性及整合子特點(diǎn)我們以產(chǎn)esbl耐熱大腸菌(extended-spectrumβ-lactamases-producingthermotolerantcoliforms,esbl-tc)為指示菌,對(duì)泰安黃前水庫(kù)中分離的esbl-tc的耐藥性、bla基因型、整合子(1、2、3類)及基因盒的特點(diǎn)進(jìn)行分析。共分離到96株非重復(fù)性esbl-tc菌株,esbl基因包括blactx-m-14(n=47),blactx-m-15(n=27),blactx-m-55(n=18),blashv-12(n=4),blactx-m-3(n=3),andblactx-m-123(n=1)。其中83株含有1類整合子(86.5%),2株含有2類整合子,整合子基因盒的大小在0.2kb至3.2kb之間。該結(jié)果表明,黃前水庫(kù)已被esbl-tc嚴(yán)重污染,成為耐藥基因的儲(chǔ)存器。4.泰安健康農(nóng)村居民中糞便攜帶ctx-m型產(chǎn)esbl腸桿菌的高流行率及風(fēng)險(xiǎn)因素分析為了解泰安地區(qū)農(nóng)村健康居民糞便中ctx-m型esbl腸桿菌科細(xì)菌的攜帶情況及相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因素。從農(nóng)村居民中共收集620份糞便樣本,篩選ctx-m陽(yáng)性腸桿菌,并應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)方法對(duì)糞便攜帶的相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因素進(jìn)行分析。458株攜帶ctx-m的腸桿菌(458/620,73.9%)分離于不同的人,最主要的基因型為ctx-m-9組(303/458,66.2%)。攜帶ctx-m基因的腸桿菌中,主要為大腸桿菌(403/458,88%)和肺炎克雷伯菌(26、458、5.7%)。所有ctx-m陽(yáng)性菌株都對(duì)氨芐西林、頭孢唑林、頭孢呋辛、頭孢曲松耐藥,但都對(duì)比阿培南、亞胺培南、美羅培南敏感。多變量邏輯回歸模型分析結(jié)果:受正規(guī)教育(or2.321;95%ci1.302 3.768;p=0.039),過去6個(gè)月內(nèi)的住院情況(or1.753;95%ci1.127 2.584;p=0.031)和過去6個(gè)月內(nèi)抗生素的使用(or1.892;95%ci1.242 2.903;p=0.034),這三個(gè)變量與ctx-m型產(chǎn)esbl陽(yáng)性菌株攜帶者具有顯著相關(guān)性(x2=21.21;df=3;p0.001)。泰安市健康農(nóng)村居民的糞便攜帶ctx-m型產(chǎn)esbl腸桿菌糞便的流行率高,主要與近期抗生素的使用和住院情況有關(guān)。5.從豬和養(yǎng)殖工作人員分離的產(chǎn)esbl大腸桿菌的特性食品性動(dòng)物一直被認(rèn)為產(chǎn)esbl大腸桿菌的存儲(chǔ)器。為分析和比較豬源與豬場(chǎng)工作人員中攜帶的產(chǎn)esbl大腸桿菌的特點(diǎn),從4個(gè)育肥豬場(chǎng)中采集60頭豬的肛門棉拭子(15個(gè)樣品/豬場(chǎng)),并采集40個(gè)豬場(chǎng)工作人員的直腸棉拭子(10人/豬場(chǎng))。從以下幾個(gè)方面對(duì)分離的產(chǎn)esbl大腸桿菌進(jìn)行分析:esbl基因型,耐藥譜,eric和多位點(diǎn)序列分型。自60份豬肛門棉拭子中分離到34株產(chǎn)esbl陽(yáng)性大腸桿菌,20.0%(8/40份)的工作人員棉拭子為產(chǎn)esbl大腸桿菌陽(yáng)性。更重要的是,同一豬場(chǎng)內(nèi)豬源和工作人員中分離到的產(chǎn)esbl大腸桿菌菌株具有相同的β-內(nèi)酰胺酶基因、耐藥譜、eric型以及相同的st型。結(jié)果表明在動(dòng)物與人之間可能存在產(chǎn)esbl大腸桿菌的傳播。6.esbls耐藥質(zhì)粒全序列分析編碼esbls基因通常位于質(zhì)粒上,并通過接合、轉(zhuǎn)座作用轉(zhuǎn)移和傳播。我們挑選了一株水源攜帶ctx-m-15基因的大腸桿菌w121,進(jìn)行體外耐藥質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移,并對(duì)質(zhì)粒dna全序列分析。攜帶的ctx-m-15耐藥性質(zhì)粒tp采用鳥槍法構(gòu)建文庫(kù)方法進(jìn)行dna測(cè)序并利用生物信息學(xué)方法分析了其編碼基因和結(jié)構(gòu)。質(zhì)粒tp全長(zhǎng)為94495bp,屬于inci1質(zhì)粒不相容性分組。質(zhì)粒全序列上共含有116個(gè)預(yù)測(cè)基因,僅攜帶兩個(gè)已知耐藥基因blactx-m-15和blatem-1。tp的基本結(jié)構(gòu)與質(zhì)粒r64非常的相似,骨架之間共線性主要位于轉(zhuǎn)移區(qū)域,并且同樣含有大腸桿菌素ib基因。耐藥質(zhì)粒tp可看作由轉(zhuǎn)座子tn3介導(dǎo)的isecp1-blactx-m-15相關(guān)元件嵌合體。類似tp質(zhì)粒上兩個(gè)不同β-內(nèi)酰胺酶基因的同時(shí)轉(zhuǎn)座,會(huì)導(dǎo)致耐藥基因的廣泛傳播,具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義,需進(jìn)一步研究。7.水源產(chǎn)esbl大腸桿菌在小鼠腸道內(nèi)滯留應(yīng)用小鼠腸道定植模型,檢測(cè)水源產(chǎn)esbl大腸桿菌耐藥基因在體內(nèi)的定植能力以及抗生素對(duì)產(chǎn)esbl大腸桿菌在腸道內(nèi)滯留的影響。小鼠接觸的飲用水污染濃度越高,耐藥菌在腸道內(nèi)滯留的時(shí)間越長(zhǎng),但最終會(huì)低于檢測(cè)水平。在抗生素(頭孢菌素)處理的小鼠中,水源大腸桿菌在腸道內(nèi)定植水平為108cfu/g;未給予抗生素的小鼠中,由于小鼠腸道固有菌群的定植拮抗作用,耐藥菌迅速下降至檢測(cè)限以下,但再給予抗生素治療后,耐藥菌直接達(dá)到可檢測(cè)水平并上升至108cfu/g糞便。此外,在小鼠腸道內(nèi)定植期間可檢測(cè)到耐藥質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移,blactx-m和blatem基因可同時(shí)轉(zhuǎn)移至腸道固有腸桿菌中�？傊茨退幋竽c桿菌能夠很好地在腸道內(nèi)定植,攜帶的質(zhì)粒在體內(nèi)具有轉(zhuǎn)移能力�？股刂委熡欣谀退幘倪x擇生長(zhǎng)及腸道內(nèi)的定植,增強(qiáng)了耐藥基因庫(kù),最終提高了耐藥基因的傳播風(fēng)險(xiǎn)。8.水源產(chǎn)esbl大腸桿菌耐藥基因在炎癥小鼠腸道內(nèi)的水平轉(zhuǎn)移首先建立小鼠腸道炎癥模型。在沙門氏菌感染的鏈霉素處理小鼠模型中,小鼠腸道炎癥促進(jìn)了供體菌(108-1011cfu/g糞便)和受體菌(108-1010cfu/g糞便)在腸道內(nèi)的共同大量增值。在大量增值的狀態(tài)下,檢測(cè)供體菌與受體菌之間質(zhì)粒tp的轉(zhuǎn)移接合率,結(jié)果發(fā)現(xiàn)接合菌(tcs)幾乎等于受體菌在腸道內(nèi)的水平,且轉(zhuǎn)移率高達(dá)近100%,顯著高于正常腸道組。說明在5dpi幾乎所有的受體菌都接受了質(zhì)粒成為tcs。在正常腸道小鼠模型中,由于腸道內(nèi)定植拮抗,供體菌、受體菌的水平顯著低于腸道炎癥組小鼠,接合菌的水平也遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于受體菌�？傊�,炎癥引發(fā)腸道內(nèi)腸桿菌的大量繁殖,使得供體菌和受體菌的密度比正常哺乳動(dòng)物腸道內(nèi)提高了100多倍。這促進(jìn)了不同腸桿菌之間遺傳物質(zhì)的重排和轉(zhuǎn)移,表明感染的病人體內(nèi)更容易發(fā)生質(zhì)粒編碼的耐藥因子的擴(kuò)散轉(zhuǎn)移(如ESBL)。9.水源產(chǎn)ESBL大腸桿菌在小鼠腸道內(nèi)質(zhì)粒水平轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制哺乳動(dòng)物腸道內(nèi)含有大量的微生物菌群,這些微生物菌群可以通過質(zhì)粒水平轉(zhuǎn)移的方式與入侵微生物之間進(jìn)行基因的交換,導(dǎo)致超級(jí)毒力或耐藥的菌株出現(xiàn),但至今其轉(zhuǎn)移機(jī)制尚不明確。為了更確切地證明是否在水源大腸桿菌(E.coli W121)與腸道固有大腸桿菌之間發(fā)生了質(zhì)粒水平轉(zhuǎn)移,以及從分子生物學(xué)角度探討其水平轉(zhuǎn)移的機(jī)制。首先利用生物信息學(xué)將Tp質(zhì)粒與固有大腸桿菌(EC615)所接受的質(zhì)粒比較,發(fā)現(xiàn)EC615質(zhì)粒(Tpinv)與Tp質(zhì)粒同源性為99%,唯一的區(qū)別在于shufflon區(qū)域的一個(gè)重復(fù)序列發(fā)生了倒置。利用基因敲除技術(shù),結(jié)果發(fā)現(xiàn)整個(gè)轉(zhuǎn)移過程中,shufflon并不起關(guān)鍵作用。再次對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行分析,我們發(fā)現(xiàn)大腸桿菌接受外源質(zhì)粒的主要原因是基于“利益驅(qū)動(dòng)”--大腸菌素(cib)。因此,本研究不僅成功建立了質(zhì)粒在腸桿菌間水平轉(zhuǎn)移的動(dòng)物模型,而且找到了其轉(zhuǎn)移的核心貢獻(xiàn)因素--大腸菌素。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S852.61;R378

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本文編號(hào)：1317081