本文關(guān)鍵詞：舒巴坦通過(guò)激活星形膠質(zhì)細(xì)胞p38 MAPK通路上調(diào)GLT-1的表達(dá)發(fā)揮抗氧葡萄糖剝奪引起的海馬神經(jīng)元死亡的作用　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)一種重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì),對(duì)維持正常腦功能至關(guān)重要,但突觸間隙過(guò)高濃度的谷氨酸同時(shí)具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性。腦缺血和再灌注后,谷氨酸的過(guò)度釋放或谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)谷氨酸清除不足可導(dǎo)致谷氨酸在突觸間隙中堆積,突觸間隙過(guò)量的谷氨酸作用于神經(jīng)元突觸后膜的離子型和代謝型谷氨酸受體,可引發(fā)興奮性毒性,例如鈣超載,鈉超載,自由基產(chǎn)生和凋亡等。腦內(nèi)細(xì)胞外沒(méi)有代謝谷氨酸的酶,腦內(nèi)細(xì)胞外谷氨酸的清除主要依靠高親和力興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體系統(tǒng)(excitatory amino acid transporters,EAATs)來(lái)維持。膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1(glial glutamate transporter-1,GLT-1)在清除細(xì)胞外谷氨酸中的作用最為重要。多種證據(jù)表明,腦缺血預(yù)處理或藥物可以通過(guò)上調(diào)GLT-1的表達(dá)及增強(qiáng)GLT-1對(duì)谷氨酸的攝取活性,對(duì)神經(jīng)元的缺血損傷發(fā)揮保護(hù)作用。Rothstein等報(bào)道,在體實(shí)驗(yàn)中,β-內(nèi)酰胺抗生素如頭孢曲松可選擇性地促進(jìn)GLT-1在腦內(nèi)的表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)中,頭孢曲松可顯著激活人胎兒星形膠質(zhì)細(xì)胞或COS7細(xì)胞系中的GLT-1啟動(dòng)子,進(jìn)而促進(jìn)GLT-1的上調(diào)。但大量使用β-內(nèi)酰胺抗生素,會(huì)帶來(lái)例如菌群失調(diào)和細(xì)菌耐藥性等多種副作用。舒巴坦是一種非典型的β-內(nèi)酰胺抗生素,抗菌能力很弱,臨床上常作為其它β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的增效劑。我室最近的研究表明,在大鼠全腦缺血模型中,舒巴坦預(yù)防性給藥,可以通過(guò)上調(diào)海馬CA1區(qū)GLT-1的表達(dá)減輕錐體神經(jīng)元的缺血性損傷。這些發(fā)現(xiàn)為應(yīng)用舒巴斯坦預(yù)防和治療腦缺血損傷的臨床研究提供了有益的基礎(chǔ)和參考。然而,在體實(shí)驗(yàn)很難證明舒巴坦對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1表達(dá)的直接作用,因此有必要利用星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),體外研究舒巴坦對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1表達(dá)的直接作用。此外,進(jìn)一步研究舒巴坦上調(diào)GLT-1的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,可更好地理解舒巴坦在腦內(nèi)的作用,促進(jìn)舒巴坦作為抗腦缺血藥物的臨床開(kāi)發(fā)和應(yīng)用研究。p38絲裂原活化蛋白激酶(p 38 mitogen-activated protein kinases,p 38 mapk)是一種重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),參與一系列生理和病理過(guò)程,包括細(xì)胞死亡和存活。p38mapk的激活如一把雙刃劍,p38mapk的過(guò)度激活可促進(jìn)腦缺血后的神經(jīng)元死亡,但也有充分證據(jù)表明p38mapk的適度激活對(duì)缺血組織器官的保護(hù)作用。我室最新研究表明,全腦缺血預(yù)處理可誘導(dǎo)大鼠海馬ca1區(qū)p38mapk適度激活,同時(shí)p38mapk的特異性抑制劑sb203580或反義寡核苷酸可抑制全腦缺血預(yù)處理誘導(dǎo)的大鼠腦缺血耐受和海馬ca1區(qū)glt-1上調(diào)。這些研究結(jié)果表明,p38mapk的適度激活可能介導(dǎo)glt-1表達(dá)的上調(diào),并誘導(dǎo)腦缺血耐受。因此,本實(shí)驗(yàn)旨在研究p38mapk信號(hào)通路在舒巴坦誘導(dǎo)的海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞glt-1表達(dá)上調(diào)和抗氧葡萄糖剝奪(oxygenglucosedeprivation,ogd)模擬缺血損傷過(guò)程中的作用。第一部分舒巴坦發(fā)揮抗氧葡萄糖剝奪引起的海馬神經(jīng)元死亡和上調(diào)海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞glt-1表達(dá)的作用目的:應(yīng)用神經(jīng)元星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù),觀(guān)察舒巴坦對(duì)ogd引起的海馬神經(jīng)元死亡的影響,探討舒巴坦的抗ogd引起的神經(jīng)元損傷作用。應(yīng)用單純星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),通過(guò)觀(guān)察在ogd狀態(tài)下,舒巴坦預(yù)孵育對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞glt-1表達(dá)的影響,證明星形膠質(zhì)細(xì)胞glt-1表達(dá)上調(diào)在舒巴坦抗ogd中的作用。方法:為觀(guān)察舒巴坦對(duì)ogd引起的海馬神經(jīng)元死亡的影響,取24h內(nèi)新生鼠海馬行神經(jīng)元星型膠質(zhì)共培養(yǎng)10天后,細(xì)胞隨機(jī)分為4組;為觀(guān)察舒巴坦預(yù)孵育對(duì)ogd后星形膠質(zhì)細(xì)胞glt-1表達(dá)的影響,取1-2天新生鼠海馬行單純星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng),并將細(xì)胞傳至3-4代,最后一代細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)瓶底后,將細(xì)胞隨機(jī)分為3組(4組中的前3組),4組如下:(1)對(duì)照組:正常培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞48h+2h+24h,以上時(shí)間段分別對(duì)應(yīng)下面實(shí)驗(yàn)分組中實(shí)驗(yàn)處理的時(shí)間段,48h對(duì)應(yīng)舒巴坦孵育的時(shí)間段,2h對(duì)應(yīng)ogd的時(shí)間段,24h對(duì)應(yīng)ogd復(fù)氧后至收集細(xì)胞的時(shí)間段。(2)ogd組:首先細(xì)胞正常培養(yǎng)48h后(對(duì)應(yīng)下一組舒巴坦孵育時(shí)間段),進(jìn)行2h的ogd后,更換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h。(3)舒巴坦+ogd組:共培養(yǎng)細(xì)胞用加入舒巴坦培養(yǎng)液中孵育48h,之后行ogd,方法同ogd組。同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照組,用ns代替舒巴坦。根據(jù)舒巴坦的劑量,進(jìn)一步分為5μm,25μm和125μm3個(gè)亞組,以觀(guān)察其量效關(guān)系。(4)舒巴坦對(duì)照組:這一實(shí)驗(yàn)組只用于共培養(yǎng)中,觀(guān)察細(xì)胞存活情況。培養(yǎng)基中加入舒巴坦生理鹽溶液(100×),在舒巴坦終濃度為125μm下孵育48小時(shí),換成正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2h+24h。共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)各組于ogd復(fù)氧后24h或相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞,赫克斯特/碘化丙啶(hoechst/propidiumiodide,ho/pi)染色法觀(guān)察計(jì)數(shù)神經(jīng)元死亡百分率,mtt法觀(guān)察細(xì)胞活力,分析舒巴坦對(duì)ogd所致的海馬神經(jīng)元死亡及損傷的影響。單純星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)各組于ogd復(fù)氧后12h和24h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)或相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)收集星形膠質(zhì)細(xì)胞,應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)和westernblot兩種方法觀(guān)察舒巴坦對(duì)ogd后星形膠質(zhì)細(xì)胞glt-1表達(dá)的影響。結(jié)果:1ho/pi染色顯示,對(duì)照組死亡細(xì)胞百分比是9.2±0.5%。2hogd可以使死亡細(xì)胞的百分比增加到71.6±2.4%,與對(duì)照組相比,死亡細(xì)胞的百分比明顯提高;而且明場(chǎng)照片與ho/pi染色熒光圖片合成后可以看出,死亡細(xì)胞主要為神經(jīng)元,說(shuō)明2h的ogd可以使神經(jīng)元的死亡百分率明顯提高。舒巴坦預(yù)孵育可以劑量依賴(lài)地降低海馬神經(jīng)元的死亡率,125μm的舒巴坦具有最好的藥效,125μm的舒巴坦預(yù)孵育可以將死亡細(xì)胞的百分比降低至15.6±1.0%。ns溶劑對(duì)照組與ogd組相比,死亡細(xì)胞的百分比無(wú)明顯差異,說(shuō)明溶劑不能改變ogd引起的海馬神經(jīng)元死亡。以上結(jié)果共同說(shuō)明,2h的ogd可以明顯增加神經(jīng)元的死亡,而舒巴坦有效的阻止了ogd引起的海馬神經(jīng)元死亡,此效應(yīng)呈現(xiàn)良好的劑量依賴(lài)性。與對(duì)照組相比,舒坦坦對(duì)照組中,正常共培養(yǎng)中加入最大濃度125μm的舒巴坦并未引起死亡細(xì)胞的百分比的改變,說(shuō)明最大濃度125μm的舒巴坦無(wú)明顯損傷作用。2mtt檢測(cè)結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組相比,2h的ogd可顯著降低共培養(yǎng)的細(xì)胞活力;而48h的舒巴坦預(yù)孵育可以劑量依賴(lài)地增加共培養(yǎng)的細(xì)胞活力,并呈現(xiàn)明顯的劑量依賴(lài)性。舒巴坦對(duì)照組的細(xì)胞活力與正常對(duì)照組相比無(wú)明顯差異,說(shuō)明最大濃度125μm的舒巴坦無(wú)明顯損傷作用。以上結(jié)果表明,舒巴坦可劑量依賴(lài)的對(duì)抗氧葡萄糖剝奪引起海馬神經(jīng)元死亡和損傷。3免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示:在對(duì)照組,glt-1廣泛表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞。與對(duì)照組相比,ogd組的glt-1表達(dá)明顯下調(diào),約為正常組的1/2-2/3。與ogd組相比,舒巴坦預(yù)孵育可以顯著上調(diào)ogd處理后的星形膠質(zhì)細(xì)胞glt-1的表達(dá),這種上調(diào)呈明顯的劑量依賴(lài)性,最大劑量125μm舒巴坦可使其表達(dá)增加至對(duì)照組的1.5-2倍,ogd組的2-3倍,并且這種上調(diào)可持續(xù)到ogd后24h,這一時(shí)間覆蓋了ogd后神經(jīng)元死亡的時(shí)間,有利于其發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用。與ogd組相比,舒巴坦的溶劑對(duì)照組glt-1的表達(dá)無(wú)明顯變化。4westernblot結(jié)果顯示:對(duì)照組glt-1有一定的基礎(chǔ)表達(dá)。與對(duì)照組相比,ogd組的glt-1表達(dá)明顯下調(diào)。與ogd組相比,舒巴坦+ogd組glt-1的表達(dá)明顯上調(diào),呈劑量依賴(lài)性,且表達(dá)上調(diào)時(shí)間可持續(xù)到到ogd復(fù)氧后24h。與ogd組相比,舒巴坦的溶劑對(duì)照組glt-1的表達(dá)無(wú)明顯變化。小結(jié):舒巴坦可劑量依賴(lài)的引起星形膠質(zhì)細(xì)胞的glt-1表達(dá)的持續(xù)上調(diào),這種上調(diào)可能是共培養(yǎng)中舒巴坦對(duì)抗ogd引起神經(jīng)元死亡的機(jī)制之一。第二部分舒巴坦序列上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞p-p38mapk和glt-1的表達(dá)目的:1觀(guān)察舒巴坦對(duì)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞glt-1、p-p38mapk和總p38mapk表達(dá)的影響。2比較舒巴坦上調(diào)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞glt-1和p-p38mapk蛋白表達(dá)的時(shí)間進(jìn)程。方法:行星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng),純化并傳至3-4代,最后1代細(xì)胞布滿(mǎn)瓶底時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。1為觀(guān)察舒巴坦對(duì)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞glt-1表達(dá)的劑量依賴(lài)性,用終濃度為5μm,25μm和125μm的舒巴坦孵育正常的星形膠質(zhì)細(xì)胞,于孵育48h后收集細(xì)胞,免疫細(xì)胞化學(xué)和westernblot法觀(guān)察不同劑量的舒巴坦對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞glt-1表達(dá)的影響。同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照組,培養(yǎng)液中只加入舒巴坦的溶劑ns。2為觀(guān)察舒巴坦對(duì)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞glt-1表達(dá)的時(shí)間進(jìn)程,用終濃度為125μm舒巴坦孵育正常的星形膠質(zhì)細(xì)胞,于舒巴坦孵育1h,3h,6h,12h,24h,48h和72h時(shí)收集細(xì)胞,免疫細(xì)胞化學(xué)和westernblot法觀(guān)察舒巴坦的不同孵育時(shí)間對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞glt-1表達(dá)的影響。同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照組,培養(yǎng)液中只加入舒巴坦的溶劑ns。3為觀(guān)察舒巴坦對(duì)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞p-p38mapk表達(dá)的劑量依賴(lài)性,用終濃度為5μm,25μm和125μm的舒巴坦孵育正常的星形膠質(zhì)細(xì)胞,于孵育48h后收集細(xì)胞,免疫細(xì)胞化學(xué)和westernblot法觀(guān)察不同劑量的舒巴坦對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞p-p38mapk表達(dá)的影響;于孵育24h后收集細(xì)胞,觀(guān)察不同劑量的舒巴坦對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞總p38mapk表達(dá)的影響。同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照組,培養(yǎng)液中只加入舒巴坦的溶劑ns。4觀(guān)察舒巴坦對(duì)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞p-p38mapk表達(dá)的時(shí)間進(jìn)程,用終濃度為125μm舒巴坦孵育正常的星形膠質(zhì)細(xì)胞,于舒巴坦孵育1h,3h,6h,12h,24h,48h和72h時(shí)收集細(xì)胞,免疫細(xì)胞化學(xué)和westernblot法觀(guān)察舒巴坦的不同孵育時(shí)間對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞p-p38mapk和總p38mapk表達(dá)的影響。同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照組,培養(yǎng)液中只加入舒巴坦的溶劑ns。結(jié)果:1在觀(guān)察舒巴坦對(duì)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞glt-1表達(dá)的劑量依賴(lài)性實(shí)驗(yàn)中,免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示:在溶劑對(duì)照組,glt-1廣泛表達(dá)于培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞。應(yīng)用舒巴坦孵育星形膠質(zhì)細(xì)胞48h,與對(duì)照組相比,5μm,25μm和125μm的舒巴坦顯著增加glt-1的表達(dá),這種上調(diào)呈劑量依賴(lài)性。westernblot分析顯示與免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果相同。2在觀(guān)察舒巴坦對(duì)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞glt-1表達(dá)的時(shí)間進(jìn)程實(shí)驗(yàn)中,免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示:在125μm的舒巴坦孵育后,與溶劑對(duì)照組相比,glt-1的表達(dá)從舒巴坦孵育12h開(kāi)始增加,48h達(dá)到高峰,72h仍維持在與較高水平。westernblot分析顯示與免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果相同。3在觀(guān)察舒巴坦對(duì)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞p-p38mapk表達(dá)的劑量依賴(lài)性實(shí)驗(yàn)中,免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示,在溶劑對(duì)照組,p-p38mapk主要表達(dá)于培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞核,細(xì)胞漿也有少量表達(dá),主要存在于細(xì)胞核周?chē)?且染色較淺,表達(dá)量較少;p38主要表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞漿,并有大量表達(dá)。免疫細(xì)胞化學(xué)和westernblot法檢測(cè)均顯示:應(yīng)用舒巴坦孵育星形膠質(zhì)細(xì)胞3h,與對(duì)照組相比,5μm,25μm和125μm的舒巴坦均顯著增加p-p38mapk的表達(dá),且這種上調(diào)呈劑量依賴(lài)性。在舒巴坦組,應(yīng)用5μm,25μm和125μm舒巴坦孵育星形膠質(zhì)細(xì)胞24h后,p38的表達(dá)與溶劑對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。westernblot分析顯示與免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果相同。4在觀(guān)察舒巴坦對(duì)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞glt-1表達(dá)的時(shí)間進(jìn)程實(shí)驗(yàn)中,免疫細(xì)胞化學(xué)和westernblot法檢測(cè)結(jié)果均顯示,在溶劑對(duì)照組,p-p38mapk有少量的表達(dá);在舒巴坦組,應(yīng)用125μm的舒巴坦孵育正常的星形膠質(zhì)細(xì)胞,與溶劑對(duì)照組相比,p-p38mapk的表達(dá)從舒巴坦孵育1h開(kāi)始增加,3h達(dá)到高峰,24h恢復(fù)到對(duì)照基礎(chǔ)水平。在舒巴坦組,應(yīng)用125μm的舒巴坦孵育正常星形膠質(zhì)細(xì)胞,總p38mapk的表達(dá)在任何時(shí)間點(diǎn)與溶劑對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異。小結(jié):1舒巴坦可上調(diào)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞的glt-1表達(dá),這種上調(diào)具有劑量依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性,舒巴坦孵育12h開(kāi)始增加,48h達(dá)到高峰,72h仍維持在與較高水平。2舒巴坦可上調(diào)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞的p-p38mapk表達(dá),這種上調(diào)具有劑量依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性,且舒巴坦對(duì)總p38mapk的表達(dá)無(wú)影響,p-p38mapk的上調(diào)為p38mapk的磷酸化激活所致。p-p38mapk的上調(diào)從舒巴坦孵育1h開(kāi)始增加,3h達(dá)到高峰,24h恢復(fù)到對(duì)照基礎(chǔ)水平。第三部分抑制p38mapk通路阻斷舒巴坦引起的正常和ogd-處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞glt-1的表達(dá)目的:應(yīng)用單純星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),觀(guān)察p-p38mapk抑制劑sb203580對(duì)正常和ogd-處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞中舒巴坦誘導(dǎo)的glt-1上調(diào)的影響,探討p-p38mapk通路是否參與正常星形膠質(zhì)細(xì)胞中舒巴坦誘導(dǎo)的glt-1的上調(diào)。方法:1行星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng),純化并傳至3-4代,最后1代細(xì)胞布滿(mǎn)瓶底時(shí)用于實(shí)驗(yàn),將細(xì)胞隨機(jī)分為以下4組:(1)對(duì)照組:正常的星形膠質(zhì)細(xì)胞在正常的培養(yǎng)基中孵育1h+48h,相當(dāng)于sb203580與舒巴坦的共同孵育時(shí)間。(2)舒巴坦組:在正常的培養(yǎng)基中孵育1h后,換成終濃度為125μm舒巴坦的培養(yǎng)液中孵育48h。(3)sb203580+舒巴坦組:首先正常星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入sb203580孵育1h,再加入終濃度為125μm的舒巴坦與sb203580共同孵育48h,根據(jù)sb203580的不同劑量分為2.5μm,5μm和10μm三個(gè)亞組。同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照組,用dmso代替sb203580。(4)sb203580對(duì)照組:用終濃度為10μm的sb203580孵育正常星形膠質(zhì)細(xì)胞1h+48h。收集以上各組的星形膠質(zhì)細(xì)胞后,應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)和westernblot兩種方法觀(guān)察各組glt-1的表達(dá),分析抑制p-p38mapk通路對(duì)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞中舒巴坦誘導(dǎo)的glt-1上調(diào)的影響。2行星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng),純化并傳至3-4代,最后1代細(xì)胞布滿(mǎn)瓶底時(shí)用于實(shí)驗(yàn),將細(xì)胞隨機(jī)分為以下4組:(1)對(duì)照組:正常星形膠質(zhì)細(xì)胞在正常的培養(yǎng)基中孵育1h+48h+2h,(相當(dāng)于sb203580先單獨(dú)孵育1h、舒巴坦和sb203580共同孵育時(shí)間48h和ogd的時(shí)間2h),換成正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12h或24h收集細(xì)胞。(2)ogd組:首先星形膠質(zhì)細(xì)胞正常培養(yǎng)1h+48h后,進(jìn)行2h的ogd后,換成正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12h或24h收集細(xì)胞。(3)舒巴坦+ogd組:星形膠質(zhì)細(xì)胞在正常的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1h,加入終濃度為125μm舒巴坦培養(yǎng)液中孵育48h,其余步驟同ogd組。(4)sb203580+舒巴坦+ogd組:正常星形膠質(zhì)細(xì)胞首先在終濃度為2.5μm,5μm和10μm的sb203580的培養(yǎng)基中孵育1h,再加入舒巴坦使其終濃度為125μm,并與sb203580共同孵育48h,其余步驟同ogd組,同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照組,用dmso代替sb203580。實(shí)驗(yàn)各組于ogd復(fù)氧后12h或24h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)及對(duì)照組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞,應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)和westernblot法,觀(guān)察各組glt-1的表達(dá),分析抑制p-p38mapk通路對(duì)舒巴坦預(yù)孵育誘導(dǎo)ogd處理后的星形膠質(zhì)細(xì)胞的glt-1上調(diào)的影響。結(jié)果:1免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示,在對(duì)照組,glt-1廣泛表達(dá)于培養(yǎng)的單純星形膠質(zhì)細(xì)胞。與對(duì)照組相比,舒巴坦組應(yīng)用125μm舒巴坦孵育星形膠質(zhì)細(xì)胞后,glt-1的表達(dá)顯著上調(diào)。與舒巴坦組相比,sb203580+舒巴坦組中應(yīng)用2.5μm,5μm,10μm的sb203580孵育,glt-1的表達(dá)明顯下調(diào),且這種下調(diào)呈顯著的劑量依賴(lài)性。溶劑對(duì)照組,與舒巴坦組相比glt-1的表達(dá)無(wú)明顯改變。與對(duì)照組相比,sb203580對(duì)照組中,用10μm的sb203580孵育正常星形膠質(zhì)細(xì)胞,glt-1的基礎(chǔ)表達(dá)無(wú)明顯改變。2westernblot的結(jié)果與免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果一致。與對(duì)照組相比,舒巴坦組的glt-1表達(dá)顯著上調(diào)。與舒巴坦組相比,sb203580+舒巴坦組的glt-1表達(dá)劑量依賴(lài)性的顯著下調(diào)。在sb203580的溶劑對(duì)照組,sb203580的溶劑對(duì)舒巴坦誘導(dǎo)的glt-1上調(diào)無(wú)影響。在sb203580對(duì)照組中,10μm的sb203580對(duì)基礎(chǔ)表達(dá)的glt-1無(wú)明顯影響。westernblot和免疫細(xì)胞化學(xué)的結(jié)果共同說(shuō)明,sb203580劑量依賴(lài)的抑制舒巴坦誘導(dǎo)的正常星形膠質(zhì)細(xì)胞的glt-1的上調(diào)。3免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示:在對(duì)照組,glt-1廣泛表達(dá)于培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞。與對(duì)照組相比,ogd組的glt-1表達(dá)明顯下調(diào),約為正常對(duì)照組的1/2-2/3。在舒巴坦+ogd組,與ogd組相比,125μm的舒巴坦預(yù)孵育48h后,可以顯著上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞的glt-1表達(dá),其表達(dá)是正常水平的1.5-2倍。在sb203580+舒巴坦+ogd組,與舒巴坦+ogd組相比,2.5μm,5μm和10μm的sb203580可以顯著抑制舒巴坦預(yù)孵育誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞glt-1的上調(diào),這種抑制作用呈劑量依賴(lài)性,10μm的sb203580表現(xiàn)出最好的抑制效果。單獨(dú)加入sb203580的溶劑對(duì)舒巴坦預(yù)孵育誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞glt-1的上調(diào)無(wú)影響。4westernblot法檢測(cè)結(jié)果與免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果相一致,結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,ogd組的glt-1表達(dá)明顯下調(diào)。在舒巴坦+ogd組,與ogd組相比,舒巴坦可以顯著上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞glt-1的表達(dá);與舒巴坦+ogd組相比,sb203580+舒巴坦+ogd組的glt-1的表達(dá)上調(diào)被顯著抑制,這種抑制呈劑量依賴(lài)性。sb203580的溶劑對(duì)舒巴坦預(yù)孵育誘導(dǎo)的glt-1上調(diào)無(wú)影響。westernblot和免疫細(xì)胞化學(xué)的結(jié)果共同說(shuō)明,sb203580可劑量依賴(lài)的抑制舒巴坦預(yù)孵育誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞glt-1的上調(diào)。小結(jié):1抑制p38mapk通路阻斷了舒巴坦誘導(dǎo)的正常星形膠質(zhì)細(xì)胞的glt-1的上調(diào),p38mapk通路參與了正常星形膠質(zhì)細(xì)胞中舒巴坦誘導(dǎo)的glt-1的上調(diào)。2抑制p38mapk通路阻斷舒巴坦引起的ogd處理后的星形膠質(zhì)細(xì)胞glt-1的表達(dá),p38mapk通路參與了舒巴坦預(yù)孵育誘導(dǎo)的ogd后星形膠質(zhì)細(xì)胞glt-1的表達(dá)上調(diào)。第四部分抑制p38mapk通路阻斷舒巴坦介導(dǎo)的海馬神經(jīng)元抗ogd作用目的:應(yīng)用神經(jīng)元星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù),觀(guān)察p38mapk抑制劑sb203580對(duì)舒巴坦抗海馬神經(jīng)元ogd作用的影響,探討p38mapk通路是否參與舒巴坦誘導(dǎo)的抗ogd損傷的神經(jīng)元保護(hù)作用。方法:取24h內(nèi)新生鼠進(jìn)行海馬神經(jīng)元星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)10天后,將細(xì)胞隨機(jī)分為以下6組:(1)對(duì)照組:正常培養(yǎng)基培養(yǎng)海馬神經(jīng)元星形膠質(zhì)細(xì)胞1h+48h+2h+24h,以上時(shí)間段分別對(duì)應(yīng)下面實(shí)驗(yàn)分組中實(shí)驗(yàn)處理的時(shí)間段,1h+48h對(duì)應(yīng)sb203580孵育時(shí)間段,48h對(duì)應(yīng)舒巴坦孵育的時(shí)間段,2h對(duì)應(yīng)ogd的時(shí)間段,24h對(duì)應(yīng)ogd復(fù)氧后至收集細(xì)胞的時(shí)間段。(2)ogd組:首先共培養(yǎng)細(xì)胞正常培養(yǎng)1+48h后(對(duì)應(yīng)sb203580孵育時(shí)間段),進(jìn)行2h氧葡萄糖剝奪后換成正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h。(3)舒巴坦+ogd組:共培養(yǎng)細(xì)胞先正常培養(yǎng)1h,加入舒巴坦培養(yǎng)液中孵育48h,之后行ogd,方法同ogd組。(4)sb203580+舒巴坦+ogd組:在含2%b27的nb培養(yǎng)基中,先加入sb203580孵育1h,培養(yǎng)液中加入終濃度為125μm的舒巴坦與sb203580繼續(xù)共同孵育48h,之后行ogd,方法同ogd組。根據(jù)sb203580的劑量進(jìn)一步分為2.5μm,5μm和10μm3個(gè)亞組,以觀(guān)察其量效關(guān)系。(5)舒巴坦對(duì)照組:先正常培養(yǎng)1h,再加入終濃度為125μm的舒巴坦孵育48小時(shí),換成正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2h+24h。(6)sb203580對(duì)照組:在正常培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基中加入10μm的sb203580孵育1+48h,換成正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2h+24h。實(shí)驗(yàn)各組于ogd復(fù)氧后24h或相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞,ho/pi染色觀(guān)察計(jì)數(shù)神經(jīng)元死亡百分率;mtt法觀(guān)察細(xì)胞活力,觀(guān)察p38mapk抑制劑sb203580對(duì)舒巴坦抗ogd發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用的影響。結(jié)果:1ho/pi雙重染色顯示,與對(duì)照組相比,125μm的舒巴坦單獨(dú)處理正常的共培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)細(xì)胞的死亡率無(wú)影響,2h的ogd可以顯著增加細(xì)胞死亡率,而125μm的舒巴坦預(yù)孵育48h可以顯著降低由ogd引起的海馬神經(jīng)元死亡。與舒巴坦+ogd組相比,sb203580+舒巴坦+ogd組應(yīng)用2.5μm,5μm和10μm的sb203580后,細(xì)胞死亡率又明顯升高,這種效應(yīng)呈明顯的劑量依賴(lài)性;在sb203580的溶劑對(duì)照組,共培養(yǎng)的細(xì)胞死亡率與舒巴坦+ogd組相比無(wú)明顯差異,說(shuō)明溶劑對(duì)舒巴坦預(yù)孵育對(duì)抗ogd而產(chǎn)生的神經(jīng)元保護(hù)作用無(wú)影響。此外,在sb203580對(duì)照組,與對(duì)照組相比,細(xì)胞死亡率無(wú)明顯改變,說(shuō)明10μm的sb203580對(duì)正常的神經(jīng)元無(wú)損傷致死作用。2mtt的結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,2h的ogd可以顯著降低共培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞活力,而舒巴坦可以顯著增加由ogd引起的共培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞活力降低。與舒巴坦+ogd組相比,sb203580+舒巴坦+ogd組中sb203580明顯降低共培養(yǎng)的細(xì)胞活力,且具有劑量依賴(lài)性。在sb203580的溶劑對(duì)照組,共培養(yǎng)的細(xì)胞活力與舒巴坦+ogd組相比無(wú)明顯差異。在sb203580對(duì)照組,與對(duì)照組相比,細(xì)胞活力無(wú)明顯改變。以上結(jié)果結(jié)合ho/pi結(jié)果,說(shuō)明sb203580可以劑量依賴(lài)的抑制舒巴坦預(yù)孵育對(duì)抗ogd而產(chǎn)生的神經(jīng)元保護(hù)作用,p-p38mapk通路參與了海馬神經(jīng)元膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)中舒巴坦對(duì)抗氧葡萄糖剝奪發(fā)揮的神經(jīng)元保護(hù)作用。小結(jié):在神經(jīng)元-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系中,抑制p38mapk通路阻斷舒巴坦介導(dǎo)的海馬神經(jīng)元抗ogd作用。結(jié)論:1舒巴坦預(yù)孵育可劑量依賴(lài)性的對(duì)抗ogd引起的海馬神經(jīng)元死亡,并可上調(diào)ogd后星形膠質(zhì)細(xì)胞glt-1表達(dá),同時(shí)維持glt-1的高表達(dá)直至ogd復(fù)氧后24h,表明舒巴坦預(yù)孵育可能通過(guò)上調(diào)并維持星形膠質(zhì)細(xì)胞的glt-1的表達(dá)對(duì)抗ogd引起的海馬神經(jīng)元死亡。2舒巴坦可劑量和時(shí)間依賴(lài)性的上調(diào)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞p-p38mapk和glt-1表達(dá),且p38的磷酸化活化明顯早于glt-1表達(dá)上調(diào)。3抑制p-p38 MAPK阻斷舒巴坦誘導(dǎo)的正常和OGD后星形膠質(zhì)細(xì)胞的GLT-1的上調(diào),p38 MAPK通路參與了舒巴坦預(yù)孵育誘導(dǎo)的正常和OGD后星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1的表達(dá)上調(diào)。4抑制p-p38 MAPK阻斷舒巴坦預(yù)孵育對(duì)抗OGD發(fā)揮的海馬神經(jīng)元保護(hù)作用。5以上表明,舒巴坦通過(guò)激活星形膠質(zhì)細(xì)胞p38 MAPK通路上調(diào)GLT-1的表達(dá)發(fā)揮抗氧葡萄糖剝奪引起的海馬神經(jīng)元死亡的作用。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R741

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10 莫永炎,姜勇,陳瑗;腦星形膠質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)功能研究進(jìn)展[J];生理科學(xué)進(jìn)展;2002年01期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 劉慶瑩;趙珠峰;朱長(zhǎng)庚;;星形膠質(zhì)細(xì)胞在癲癇復(fù)發(fā)中的作用[A];解剖學(xué)雜志——中國(guó)解剖學(xué)會(huì)2002年年會(huì)文摘匯編[C];2002年

2 唐愛(ài)輝;王同飛;王世強(qiáng);;星形膠質(zhì)細(xì)胞鈣活動(dòng):腦細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)中的第二興奮系統(tǒng)?[A];中國(guó)神經(jīng)科學(xué)學(xué)會(huì)第六屆學(xué)術(shù)會(huì)議暨學(xué)會(huì)成立十周年慶祝大會(huì)論文摘要匯編[C];2005年

3 池美珠;陳超;錢(qián)燕;李劍敏;吳步猛;;產(chǎn)前重復(fù)激素治療對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育的影響[A];浙江省圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2005年

4 魏爾清;;半胱氨酰白三烯受體對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用[A];中國(guó)藥理學(xué)會(huì)第九次全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨全國(guó)藥理學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2007年

5 吳建云;王鮮忠;王劍;諶劍波;范光麗;張家驊;;大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物解剖學(xué)及組織胚胎學(xué)分會(huì)第十五次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2008年

6 趙玉武;程曉娟;;星形膠質(zhì)細(xì)胞與腦水腫的形成[A];山東省2013年神經(jīng)內(nèi)科學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議暨中國(guó)神經(jīng)免疫大會(huì)2013論文匯編[C];2013年

7 董其平;柴真;;谷氨酸對(duì)培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的鈣活動(dòng)的影響[A];“基因、進(jìn)化與生理功能多樣性”海內(nèi)外學(xué)術(shù)研討會(huì)暨中國(guó)生理學(xué)會(huì)第七屆比較生理學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要[C];2009年

8 曾俊;李康生;;柯薩奇病毒感染星形膠質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞因子變化研究[A];新發(fā)和再發(fā)傳染病防治熱點(diǎn)研討會(huì)論文集[C];2010年

9 鮑歡;徐曉云;顧曉波;徐霞紅;胡暉;;缺氧后水通道蛋白4在體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)變化的實(shí)驗(yàn)研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十三次全國(guó)神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2010年

10 熊加祥;白云;宋敏;王艷艷;楊曉亞;;星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)免疫分子維持大腦免疫穩(wěn)態(tài)[A];中國(guó)神經(jīng)科學(xué)學(xué)會(huì)第六屆學(xué)術(shù)會(huì)議暨學(xué)會(huì)成立十周年慶祝大會(huì)論文摘要匯編[C];2005年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前7條

1 記者 胡德榮;星形膠質(zhì)細(xì)胞由“天使”變“魔鬼”原因找到[N];健康報(bào);2012年

2 記者 劉海英;星形膠質(zhì)細(xì)胞可調(diào)節(jié)呼吸強(qiáng)度[N];科技日?qǐng)?bào);2010年

3 劉霞;腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)室培育成功[N];科技日?qǐng)?bào);2011年

4 汪敏華;大腦星形膠質(zhì)細(xì)胞有兩種新功能[N];解放日?qǐng)?bào);2003年

5 吳一福;黃芪可調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞“時(shí)間模式”[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2005年

6 南方日?qǐng)?bào)記者 曹斯　實(shí)習(xí)生 趙莞 張寧 通訊員 鄒瑩 張淼;用ATP對(duì)抗不快樂(lè)[N];南方日?qǐng)?bào);2013年

7 記者 班瑋;德國(guó)腦細(xì)胞再生研究取得新進(jìn)展[N];人民日?qǐng)?bào);2010年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 曾招;離子通道TRPM7調(diào)節(jié)細(xì)胞生理的分子機(jī)制研究[D];蘇州大學(xué);2014年

2 黃維一;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌因子對(duì)缺血性腦卒中后星形膠質(zhì)細(xì)胞活性及功能的影響[D];南方醫(yī)科大學(xué);2015年

3 楊俊華;星形膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的ATP促進(jìn)丘腦中的突觸刪除[D];浙江大學(xué);2015年

4 鄧雅婷;龍膽苦苷鎮(zhèn)痛與抗抑郁的中樞作用及機(jī)制研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2015年

5 李新;星形膠質(zhì)細(xì)胞NDRG2在七氟烷預(yù)處理神經(jīng)保護(hù)作用中的機(jī)制研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2015年

6 鐘志宏;亞鐵離子對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷作用及香芹酚在實(shí)驗(yàn)性腦出血中的神經(jīng)保護(hù)作用[D];上海交通大學(xué);2014年

7 洪洋;孕酮對(duì)Aβ所致星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2016年

8 凌云志;帕瑞昔布減輕過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的作用及機(jī)制研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2015年

9 徐進(jìn);腦出血后星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4內(nèi)化及其機(jī)制的研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2015年

10 唐文紅;NDRG2調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取谷氨酸的作用及機(jī)制研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2016年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 龔佩佩;磷酸化MSK1在星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥活化過(guò)程中的作用的研究[D];南通大學(xué);2013年

2 何潔玉;糖皮質(zhì)激素對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌GnRH的調(diào)控機(jī)制[D];西南大學(xué);2015年

3 張麗麗;脂肪基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)程中線(xiàn)粒體凋亡與自噬的關(guān)系[D];河北聯(lián)合大學(xué);2014年

4 燕茹;高同型半胱氨酸血癥致ApoE~(-/-)小鼠腦血管、星形膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元損傷作用研究[D];寧夏醫(yī)科大學(xué);2015年

5 米鵬霞;P物質(zhì)對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化作用及機(jī)制研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2015年

6 楊志奇;小鼠皮層內(nèi)移植膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)及功能重建研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

7 陳雅南;敲除星形膠質(zhì)細(xì)胞的dicer對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響[D];杭州師范大學(xué);2015年

8 馬輝;星形膠質(zhì)細(xì)胞上酸敏感離子通道1a在顳葉癲癇發(fā)生中的作用研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2015年

9 周亞蘭;IFN-γ介導(dǎo)T細(xì)胞參與炎性痛慢性化機(jī)制的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2015年

10 鄧子輝;瘦素抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞縫隙連接蛋白-43表達(dá)改善腦缺血再灌注損傷的機(jī)制研究[D];中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2015年

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本文編號(hào)：1316883