本文關(guān)鍵詞：D-Ala2-GIP-glu-PAL對(duì)MPTP誘導(dǎo)的急性和慢性帕金森病小鼠模型的神經(jīng)保護(hù)作用　出處：《山西醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的:1.研究D-Ala2-GIP-glu-PAL對(duì)MPTP誘導(dǎo)的急性和慢性帕金森病(Parkinson’s disease,PD)小鼠模型的PD樣癥狀、黑質(zhì)和紋狀體多巴胺能神經(jīng)元和神經(jīng)纖維的丟失、α-突觸核蛋白的表達(dá)增多等病理?yè)p害是否具有逆轉(zhuǎn)作用。探討D-Ala2-GIP-glu-PAL是否對(duì)PD小鼠模型具有神經(jīng)保護(hù)作用。2.研究D-Ala2-GIP-glu-PAL是否能夠抑制急性PD小鼠黑質(zhì)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活,調(diào)節(jié)凋亡基因Bax和Bcl-2的表達(dá),以及p-CREBS133的表達(dá),來(lái)探討D-Ala2-GIP-glu-PAL治療急性PD小鼠模型的作用機(jī)制。3.研究D-Ala2-GIP-glu-PAL是否能夠抑制慢性PD小鼠黑質(zhì)和紋狀體的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活,抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),調(diào)節(jié)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Bain-derived neurotrophic factor,BDNF)的表達(dá),來(lái)探討D-Ala2-GIP-glu-PAL治療慢性PD小鼠模型的作用機(jī)制。方法:1.急性PD模型1.1動(dòng)物分組和給藥:體重25 g左右的雄性C57BL/6小鼠32只,隨機(jī)分為四組:對(duì)照組、D-Ala2-GIP-glu-PAL組、MPTP組(模型組)和MPTP+D-Ala2-GIP-glu-PAL組(給藥組),每組8只。模型組和給藥組小鼠經(jīng)腹腔注射MPTP(20 mg/kg體重),連續(xù)4次,每次間隔2小時(shí),對(duì)照組和D-Ala2-GIP-glu-PAL組注射等量的生理鹽水。在MPTP注射后的第2天,MPTP+D-Ala2-GIP-glu-PAL組小鼠經(jīng)腹腔注射D-Ala2-GIP-glu-PAL(25nmol/kg體重),對(duì)照組和MPTP組給與等量的生理鹽水,D-Ala2-GIP-glu-PAL組注射等量的D-Ala2-GIP-glu-PAL,連續(xù)7天。1.2行為學(xué)實(shí)驗(yàn):在MPTP注射后的第5天進(jìn)行爬桿實(shí)驗(yàn),第6天進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)。1.3取材:所有小鼠于mptp注射后的第7天處死,每組4只取全腦固定后石蠟包埋切片用于免疫組織化學(xué)染色。每組其余4只取新鮮全腦分離出腹側(cè)中腦(含黑質(zhì)(snpc)),用于westernblot實(shí)驗(yàn)。1.4采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)小鼠黑質(zhì)和紋狀體酪氨酸羥化酶(tyrosinehydroxylase,th)的表達(dá),黑質(zhì)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein,gfap)和離子鈣接頭蛋白(ionizedcalcium-bindingadaptormolecule1,iba1)的表達(dá)。1.5采用westernblot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠黑質(zhì)突觸素(synaptophysin,syn)、bax、bcl-2、p-crebs133的表達(dá)。2.慢性pd模型2.1動(dòng)物分組和給藥:體重25g左右的雄性c57bl/6小鼠48只,隨機(jī)分為四組:對(duì)照組、d-ala2-gip-glu-pal組、mptp+丙磺舒組(模型組)和mptp+丙磺舒+d-ala2-gip-glu-pal(給藥組)組,每組12只。模型組和給藥組小鼠經(jīng)腹腔注射mptp(20mg/kg體重)和丙磺舒(250mg/kg體重),每3.5天重復(fù)注射一次,共注射10次,對(duì)照組和d-ala2-gip-glu-pal組注射等量的生理鹽水。從mptp和丙磺舒注射后的第二天,給藥組和d-ala2-gip-glu-pal組小鼠經(jīng)腹腔注射d-ala2-gip-glu-pal(25nmol/kg體重),模型組和對(duì)照組給與等量的生理鹽水,每天1次,連續(xù)6周。2.2行為學(xué)實(shí)驗(yàn):在mptp和丙磺舒注射后的第6周進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、爬桿實(shí)驗(yàn)和轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)。2.3取材:所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于第6周末處死,每組6只取新鮮全腦分離出腹側(cè)中腦(含黑質(zhì))用于westernblot實(shí)驗(yàn)。每組其余6只取全腦固定后石蠟包埋切片用于免疫組織化學(xué)染色。2.4采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)小鼠黑質(zhì)和紋狀體th、α-突觸核蛋白、gfap、iba1、4-羥基壬烯醛(4-hydroxynonenal,4-hne)的表達(dá),以及黑質(zhì)bdnf的表達(dá)。2.5采用westernblot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠黑質(zhì)α-突觸核蛋白和bdnf的表達(dá)。結(jié)果:1.急性pd模型1.1行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示mptp組小鼠跨越格子的數(shù)目和后腳站立的次數(shù)均明顯少于對(duì)照組(p0.01),而mptp+d-ala2-gip-glu-pal組小鼠跨越格子的數(shù)目和后腳站立的次數(shù)卻明顯多于mptp組(p0.05)。爬桿實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示mptp組小鼠的t-turn和t-la均明顯多于對(duì)照組(p0.001),而mptp+d-ala2-gip-glu-pal組小鼠的t-turn和t-la卻明顯少于mptp組(p0.01)。1.2免疫組化染色結(jié)果:mptp組snpc的th(+)神經(jīng)元的數(shù)目降低到了對(duì)照組的27.00%(p0.001),而mptp+d-ala2-gip-glu-pal組snpc的th(+)神經(jīng)元的數(shù)目卻明顯高于mptp組(p0.05),為對(duì)照組的59.4%。mptp組紋狀體的th(+)神經(jīng)纖維的染色強(qiáng)度降低到了對(duì)照組的56.86%(p0.001),而mptp+d-ala2-gip-glu-pal組紋狀體的th(+)神經(jīng)纖維的染色強(qiáng)度卻明顯高于mptp組(p0.01),為對(duì)照組的83.64%。mptp組黑質(zhì)的gfap(+)細(xì)胞的面積百分比和iba1(+)細(xì)胞的面積百分比均明顯大于對(duì)照組(p0.001),而mptp+d-ala2-gip-glu-pal組黑質(zhì)的gfap(+)細(xì)胞的面積百分比和iba1(+)細(xì)胞的面積百分比與mptp組比較均明顯降低(p0.001)。1.3westernblot結(jié)果:mptp組黑質(zhì)syn的表達(dá)明顯低于對(duì)照組(p0.001),而mptp+d-ala2-gip-glu-pal組小鼠黑質(zhì)syn的表達(dá)卻明顯高于mptp組(p0.01)。與對(duì)照組比較,mptp組黑質(zhì)bax的表達(dá)略微升高,而bcl-2的表達(dá)明顯降低,bax/bcl-2比值明顯升高(p0.001)。mptp+d-ala2-gip-glu-pal組小鼠黑質(zhì)bax的表達(dá)雖然與mptp組無(wú)明顯差異,但bcl-2的表達(dá)明顯升高,bax/bcl-2比值與mptp組比較明顯降低(p0.01)。mptp組黑質(zhì)p-crebs133的表達(dá)較對(duì)照組明顯降低(p0.001),而mptp+d-ala2-gip-glu-pal組小鼠黑質(zhì)p-crebs133的表達(dá)與mptp組比較略微升高(p0.05)。2.慢性pd模型2.1行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示mptp+丙磺舒組小鼠跨越格子的數(shù)目和后腳站立的次數(shù)均明顯少于對(duì)照組(p0.01),而mptp+丙磺舒+d-ala2-gip-glu-pal組小鼠跨越格子的數(shù)目和后腳站立的次數(shù)卻均明顯多于mptp+丙磺舒組(p0.05)。爬桿實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示mptp+丙磺舒組小鼠的t-turn和t-la均明顯多于對(duì)照組(p0.001),而mptp+丙磺舒+d-ala2-gip-glu-pal組小鼠的t-turn和t-la卻均明顯少于mptp+丙磺舒組(p0.05)。轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示mptp+丙磺舒組小鼠的掉落潛伏期明顯少于對(duì)照組(p0.001),而mptp+丙磺舒+d-ala2-gip-glu-pal組小鼠的掉落潛伏期卻明顯長(zhǎng)于mptp+丙磺舒組(p0.05)。2.2免疫組化染色結(jié)果:mptp+丙磺舒組黑質(zhì)的th(+)神經(jīng)元的數(shù)目降低到了對(duì)照組的33.99%(p0.001)。而mptp+丙磺舒+d-ala2-gip-glu-pal組黑質(zhì)的th(+)神經(jīng)元的數(shù)目卻明顯高于mptp+丙磺舒組(p0.05),為對(duì)照組的59.21%。mptp+丙磺舒組紋狀體的th(+)神經(jīng)纖維的染色強(qiáng)度降低到了對(duì)照組的56.75%(p0.001)。而mptp+丙磺舒+d-ala2-gip-glu-pal組紋狀體的th(+)神經(jīng)纖維的染色強(qiáng)度卻明顯高于mptp+丙磺舒組(p0.01),為對(duì)照組的73.33%。mptp+丙磺舒組小鼠的黑質(zhì)和紋狀體α-突觸核蛋白的染色明顯強(qiáng)于對(duì)照組(p0.001),并且黑質(zhì)存在大量α-突觸核蛋白強(qiáng)陽(yáng)性的神經(jīng)元胞體。然而mptp+丙磺舒+d-ala2-gip-glu-pal組黑質(zhì)和紋狀體α-突觸核蛋白的染色卻明顯弱于mptp+丙磺舒組(p0.05)。mptp+丙磺舒組黑質(zhì)和紋狀體的gfap(+)細(xì)胞的面積百分比和iba1(+)細(xì)胞的面積百分比均明顯大于對(duì)照組(p0.001)。而mptp+丙磺舒+d-ala2-gip-glu-pal組黑質(zhì)和紋狀體的gfap(+)細(xì)胞的面積百分比和iba1(+)細(xì)胞的面積百分比與mptp+丙磺舒組比較均明顯降低(p0.001)。mptp+丙磺舒組小鼠黑質(zhì)和紋狀體的4-hne染色強(qiáng)度均明顯高于對(duì)照組(p0.001),而mptp+丙磺舒+d-ala2-gip-glu-pal組小鼠黑質(zhì)和紋狀體的4-hne染色強(qiáng)度卻明顯低于mptp+丙磺舒組(p0.05)。mptp+丙磺舒組小鼠黑質(zhì)的bdnf(+)細(xì)胞的面積明顯低于對(duì)照組(p0.001),而mptp+丙磺舒+d-ala2-gip-glu-pal組小鼠黑質(zhì)bdnf(+)細(xì)胞的面積卻明顯高于mptp+丙磺舒組(p0.05)。2.3westernblot結(jié)果:mptp+丙磺舒組黑質(zhì)α-突觸核蛋白的表達(dá)明顯高于對(duì)照組(p0.001),而mptp+丙磺舒+d-ala2-gip-glu-pal組小鼠黑質(zhì)α-突觸核蛋白的表達(dá)卻明顯低于mptp+丙磺舒組(p0.05)。mptp+丙磺舒組小鼠黑質(zhì)的bdnf表達(dá)明顯低于對(duì)照組(P0.001),而MPTP+丙磺舒+D-Ala2-GIP-glu-PAL組小鼠黑質(zhì)BDNF的表達(dá)卻明顯高于MPTP+丙磺舒組(P0.05)。結(jié)論:1.D-Ala2-GIP-glu-PAL不僅改善了MPTP誘導(dǎo)的急性和慢性PD小鼠模型的運(yùn)動(dòng)癥狀,而且抑制了黑質(zhì)和紋狀體多巴胺能神經(jīng)元及其纖維的丟失、α-突觸核蛋白的表達(dá)增多等典型病理表現(xiàn),發(fā)揮了神經(jīng)保護(hù)作用。2.D-Ala2-GIP-glu-PAL發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用機(jī)制可能與激活黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元GIP-R信號(hào)傳導(dǎo)通路,調(diào)節(jié)CREB介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)BCL-2表達(dá),抑制細(xì)胞凋亡,抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),促進(jìn)BDNF的生成,抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞激活和神經(jīng)炎癥反應(yīng)等有關(guān)。本課題為山西醫(yī)科大學(xué)李琳教授與2015年山西省高校“131”領(lǐng)軍人才、第二層次人才英國(guó)蘭卡斯特大學(xué)Christian Holscher教授合作科研計(jì)劃“the use of GIP analogues in diseases of loss of synaptic transmission”。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R742.5;R-332

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本文編號(hào)：1314085