本文關(guān)鍵詞：MIP-2對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞反應(yīng)的作用及機(jī)制研究　出處：《浙江大學(xué)》2017年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 巨噬細(xì)胞 RAW264.7 LPS 肝衰竭 MIP-2 高遷移率族蛋白1

【摘要】：肝衰竭的發(fā)生機(jī)制尚不十分清楚,闡明肝衰竭發(fā)病機(jī)制,采取早期干預(yù)措施減輕肝臟炎癥,對(duì)進(jìn)一步治療肝衰竭以及降低其"病死率"具有重要意義。肝衰竭時(shí),巨噬細(xì)胞釋放的趨化因子和促炎細(xì)胞因子在炎癥重癥化中起著重要作用。在炎癥早期釋放的MIP-2,趨化激活中性粒細(xì)胞到炎癥部位,激活的中性粒細(xì)胞釋放大量蛋白水解酶造成肝細(xì)胞進(jìn)一步壞死加劇;而到炎癥晚期巨噬細(xì)胞主動(dòng)釋放重要晚期致炎因子高遷移率族蛋白1(HMGB1),則使炎癥重癥化發(fā)生炎癥細(xì)胞因子風(fēng)暴。本課題旨在使用LPS活化巨噬細(xì)胞,探索炎癥早期巨噬細(xì)胞釋放的趨化因子MIP-2,在炎癥晚期炎癥重癥化過(guò)程中的作用,并進(jìn)一步研究其機(jī)制。本論文分為以下三個(gè)部分:第一部分mip-2 siRNA序列的篩選目的 體外篩選最優(yōu)mip-2 siRNA序列,并研究其作用。方法 不同劑量LPS處理RAW264.7細(xì)胞,在0-24小時(shí)不同時(shí)間點(diǎn)提取細(xì)胞總RNA,用RT-PCR檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞中mip-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平,確定較優(yōu)劑量。不同序列siRNA處理24h后,使用最適LPS劑量處理RAW264.7細(xì)胞2h,提取細(xì)胞總RNA,用RT-PCR檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞中mip-2和HMGB1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平,確定干擾效果最優(yōu)siRNA序列。選出最優(yōu)siRNA序列,干擾RAW264.7細(xì)胞后再用LPS處理2h,提取細(xì)胞總RNA,用RT-PCR檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子 IL-6、TNF-α、IL-1β、iNOS、CCL2、TLR4 以及 HMGB1 的mRNA相對(duì)表達(dá)水平;取細(xì)胞培養(yǎng)上清,ELISA檢測(cè)TNF-α、IL-6、IL-1β的蛋白表達(dá)水平;RAW264.7細(xì)胞經(jīng)干擾后再用LPS處理24h,提取細(xì)胞總RNA和總蛋白,并用RT-PCR及Western Blot試驗(yàn)檢測(cè)HMGB1蛋白表達(dá)。結(jié)果 1、在不同的LPS劑量范圍內(nèi),暴露于LPS的RAW264.7細(xì)胞中mip-2 mRNA相對(duì)表達(dá)與LPS劑量呈劑量效應(yīng)關(guān)系;2、不同序列干擾序列處理24h后,使用0.25μg/mL最適劑量LPS處理Raw264.7 細(xì)胞 2h 或 24h,用 RT-PCR 檢測(cè) RAW264.7 細(xì)胞中 mip-2 和 HMGB1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平,確定si5為干擾效果最優(yōu)siRNA序列;3、mip-2 siRNA能顯著降低暴露于LPS的RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β、TNF-a和IL-6蛋白表達(dá)水平,且呈劑量依賴(lài)性;4、mip-2 siRNA能顯著降低暴露于LPS的RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6、TNF-α、IL-1β、iNOS、CCL2 的 mRNA 表達(dá)水平;5、mip-2 siRNA顯著減少HMGB1的mRNA和蛋白以及TLR4 mRNA水平的表達(dá)。結(jié)論 1、0.25μg/mL劑量LPS為最佳劑量;2、標(biāo)記為si5的干擾序列為最優(yōu)干擾序列;3、mip-2 siRNA能阻斷LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的炎癥效應(yīng);4、HMGB1表達(dá)下調(diào)是mip-2 siRNA的作用機(jī)制之一;5、mip-2 siRRA也可影響HMGB1-TLR4通路。第二部分 MIP-2抗體減輕炎癥作用,并通過(guò)PI3K/AKTs、JAK/STAT3和P38-MAPK信號(hào)通路抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞HMGB1的釋放。目的研究MIP-2抗體的抗炎作用及機(jī)制。方法 同時(shí)經(jīng)MIP-2抗體或不經(jīng)MIP-2抗體處理的RAW264.7細(xì)胞,暴露于0.25μg/mL劑量LPS 24小時(shí)后,后用ELISA法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表達(dá)水平,用Western Blot試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞中HMGB1的蛋白表達(dá)以及PI3K/AKTs、JAK/STAT3和MAPKs信號(hào)通路蛋白磷酸化水平的比率表達(dá);使用PI3K/AKTs、JAK/STAT3和MAPKs信號(hào)通路抑制劑處理RAW264.7細(xì)胞2h后,再暴露于0.25μg/mL劑量LPS24小時(shí),后用ELISA法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平,并用Western Blot試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞中HMGB1蛋白表達(dá);將RAW264.7細(xì)胞暴露于0.25μg/mL劑量LPS,在0-36h內(nèi)分別使用HMGB1蛋白抑制劑EP處理RAW264.7細(xì)胞,36h后用ELISA法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平;此后再暴露于0.25μg/mL劑量LPS,在一定時(shí)間范圍內(nèi)使用MIP-2抗體處理RAW264.7細(xì)胞,之后用ELISA法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-6、IL-1β、HMGB1蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 1、MIP-2抗體能顯著減少細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-6、IL-1β的表達(dá)水平;2、MIP-2抗體顯著減少細(xì)胞中HMGB1的蛋白表達(dá)且呈計(jì)量依賴(lài)性,以及PI3K/AKTs、JAK/STAT3、p38-MAPK信號(hào)通路蛋白磷酸化水平的比率;3、PI3K/AKTs、JAK/STAT3和p38-MAPK信號(hào)通路抑制劑顯著減少細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表達(dá)水平以及HMGB1蛋白表達(dá);4、RAW264.7細(xì)胞在LPS處理后6h內(nèi)加入MIP-2抗體能顯著減少細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-6、IL-1β、HMGB1蛋白表達(dá)水平。結(jié)論 1、MIP-2抗體拮抗LPS引起RAW264.7細(xì)胞炎癥應(yīng)答;2、下調(diào)HMGB1表達(dá)是MIP-2抗體抗炎機(jī)制之一,這與PI3K/AKT、JAK/STAT和MAPKs信號(hào)通路有關(guān);3、LPS處理后6h內(nèi)加入MIP-2抗體,能起到抑制RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用。第三部分小鼠源性重組MIP-2蛋白促炎作用的體外研究目的研究小鼠源性重組MIP-2蛋白促炎作用。方法 RAW264.7細(xì)胞經(jīng)30ng/mL濃度的小鼠源性重組MIP-2蛋白處理2小時(shí),再經(jīng)LPS處理24h,后用ELISA法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α IL-6、IL-1β蛋白表達(dá)水平;RAW264.7細(xì)胞經(jīng)30ng/mL濃度的小鼠源性重組MIP-2蛋白處理2小時(shí),再經(jīng)MIP-2抗體或不經(jīng)MIP-2抗體處理24h,后用ELISA法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表達(dá)水平,并用Western Blot試驗(yàn)檢測(cè)HMGB1的蛋白表達(dá)。結(jié)果 1、MIP-2重組蛋白能顯著升高經(jīng)LPS處理的細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-6、IL-1β的表達(dá)水平;2、MIP-2重組蛋白能顯著升高細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-6、IL-1β的表達(dá)水平;3、MIP-2重組蛋白能顯著升高細(xì)胞HMGB1蛋白的表達(dá)。結(jié)論 1、MIP-2重組蛋白能增加LPS引起的RAW264.7細(xì)胞炎癥應(yīng)答;2、MIP-2重組蛋白引起RAW264.7細(xì)胞炎癥應(yīng)答;3、MIP-2重組蛋白促炎作用與增高細(xì)胞HMGB1蛋白表達(dá)有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R575.3

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5 李

本文編號(hào)：1313783