本文關(guān)鍵詞：雷帕霉素對腹膜纖維化的抑制作用及其機制研究　出處：《浙江大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 腹膜透析 腹膜纖維化 高糖 雷帕霉素 腹膜間皮細(xì)胞 高糖 雷帕霉素 間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化 腹膜間皮細(xì)胞 高糖 雷帕霉素 間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化 PI3K/Akt/mTOR 通路 RhoGTPases 細(xì)胞骨架

【摘要】：研究背景:腹膜纖維化迄今仍然是一個世界性的難題,是導(dǎo)致尿毒癥患者被迫中斷長期腹膜透析(peritoneal dialysis,PD)的最主要因素,目前尚無有效的治療方法。在非生理性腹膜透析液的長期刺激下,就會導(dǎo)致腹膜纖維化的發(fā)生,其重要機理是腹膜間皮細(xì)胞從上皮細(xì)胞表型向肌纖維母細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化,即上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT)過程的發(fā)生,由此啟動細(xì)胞增殖和膠原等基質(zhì)的積聚等,主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)涉及到TGF-β-Smad通路、PI3-K/Akt/mTOR途徑等。雷帕霉素(rapmycin),通過與FK結(jié)合蛋白(FK-binding protein,FKBP)結(jié)合,抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)的活性,進(jìn)而抑制細(xì)胞生長與增殖。在腎、肝、心等多個臟器領(lǐng)域的研究中雷帕霉素在抗增殖和抗纖維化方面已經(jīng)顯示了重要作用。而雷帕霉素在防治腹膜纖維化方面的報道非常少且機制仍未闡明。Rho GTPases作為Ras超家族的一個亞族,通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重構(gòu)及基因轉(zhuǎn)錄,調(diào)控了大量如細(xì)胞極化、細(xì)胞的黏附及遷移、分化、增殖等的細(xì)胞活動。其中研究的最多的三個成員是RhoA、Rac1和Cdc42。研究表明,Rho GTPases在EMT過程中起到了至關(guān)重要的作用。此外,研究證實,mTOR與Rho GTPases之間的信號交互作用,參與介導(dǎo)了多種細(xì)胞EMT及纖維化病變的發(fā)生過程;而雷帕霉素通過阻斷mTOR的表達(dá)抑制部分Rho GTPase的活性,進(jìn)而抑制EMT。目前mTOR與Rho GTPases在腹膜纖維化中作用的研究尚未見報道�；谝陨戏治�,我們認(rèn)為雷帕霉素可能通過調(diào)節(jié)Rho GTPases的活性抑制腹膜間皮細(xì)胞EMT及腹膜纖維化的過程。為此,本研究開展如下。第一部分雷帕霉素有效抑制腹膜透析大鼠腹膜纖維化研究目的:明確雷帕霉素對于腹膜透析模型大鼠腹膜纖維化的防治效果實驗方法:取45只正常SD大鼠,隨機分為5組:正常組,生理鹽水組,高糖組,低濃度雷帕治療組,高濃度雷帕治療組,處理6周后處死,評估腹膜功能,取腹膜組織,行HE染色及α-肌動蛋白(smooth muscle actin-alpha,α-SMA)及轉(zhuǎn)化生長因子-βI(transforminggrowth factorβ1,TGF-β1)的免疫組化染色,分析各組腹膜纖維化情況,Western Blot及realtime PCR檢測α-SMA、TGF-β1的表達(dá)變化。結(jié)果:高糖組大鼠的腹膜功能相較正常組及生理鹽水組明顯下降,低濃度雷帕及高濃度雷帕均顯著改善腹膜功能;HE染色顯示,高糖組呈現(xiàn)腹膜纖維化狀態(tài),腹膜厚度明顯增加,低濃度雷帕及高濃度雷帕均顯著改善腹膜纖維化狀態(tài),且呈濃度相關(guān)性。免疫組化、Western BIot及realtime PCR顯示,高塘組α-SMA、TGF-β1蛋白及mRNA表達(dá)較對照組明顯升高,雷帕組表達(dá)明顯下降,且呈濃度相關(guān)性。結(jié)論:通過動物層面驗證了雷帕霉素對腹膜纖維化有明顯的防治作用,在有效濃度范圍內(nèi),其防治效果與劑量呈一定的正相關(guān)。雷帕霉素減少TGF-β的分泌,抑制成纖維細(xì)胞的形成,抑制細(xì)胞外基質(zhì)形成。第二部分雷帕霉素抑制高糖誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞EMT的研究研究目的:明確雷帕霉素對于腹膜間皮細(xì)胞EMT的抑制作用實驗方法:取正常SD大鼠腹膜,原代培養(yǎng)腹膜間皮細(xì)胞,取第3-4代細(xì)胞,予以不同濃度高糖(30,60,120mM)干預(yù),及不同濃度雷帕霉素(10,100nM)干預(yù)一定時間,通過Western Blot檢測細(xì)胞中α-SMA及E-鈣粘蛋白(E-cadherin)的表達(dá),通過realtimePCR檢測α-SMA、纖維連接蛋白(Fibronectin)及膠原蛋白I(Collagen-I)的表達(dá);細(xì)胞劃痕實驗及Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移能力的變化。結(jié)果:高糖處理后,α-SMA、Fibronectin、CollagenI的表達(dá)量相較正常組明顯升高,E-cadherin的表達(dá)量明顯下降,細(xì)胞遷移能力明顯增加。與高塘組相比,雷帕霉素使α-SMA、Fibronectin、Collagen I的表達(dá)明顯下降,E-cadherin的表達(dá)明顯升高,細(xì)胞遷移能力明顯下降,且呈濃度相關(guān)性。結(jié)論:高糖處理后腹膜間皮細(xì)胞呈現(xiàn)EMT改變,雷帕霉素有效抑制高糖誘導(dǎo)的腹膜間皮細(xì)胞EMT。第三部分雷帕霉素通過抑制Rho GTPases的活性逆轉(zhuǎn)腹膜間皮細(xì)胞EMT研究目的:探索雷帕霉素抑制腹膜間皮細(xì)胞EMT的具體作用機制實驗方法:取原代培養(yǎng)腹膜間皮細(xì)胞,予以不同濃度高糖(30,60,120mM)干預(yù),及不同濃度雷帕霉素(l0,l00nM)干預(yù)一定時間,通過Western Blot檢測細(xì)胞中磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate3-kinase,PI3K)的、p-PI3K、蛋白激酶 B(PKB 或 Akt)、p-Akt、mTOR、p-mTOR的表達(dá);通過pull down方法檢測GTP-RhoA、GTP-Rac1、GTP-Cdc2蛋白的表達(dá);通過細(xì)胞免疫熒光方法觀察細(xì)胞骨架的變化情況。結(jié)果:高糖處理后,p-PI3K、p-Akt、p-mTOR的表達(dá)量相較正常組明顯升高,雷帕霉素明顯減少p-mTOR的表達(dá)量;Pull down實驗顯示,RhoA、Rac1及Cdc42的GTP活化水平在高糖刺激后明顯升高,雷帕霉素使三者的GTP水平明顯下降;細(xì)胞免疫熒光實驗顯示,正常的腹膜間皮細(xì)胞呈現(xiàn)少量的應(yīng)力纖維(stress fiber)、粘著斑(focal adhesion)、板狀偽足(lamellipodia)、絲狀偽足(filopodia),高糖刺激使得腹膜間皮細(xì)胞形成更多的 stress fiber、focal adhesion、lamellipodia、filopodia,而雷帕霉素明顯減少這些細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的形成,使其恢復(fù)至接近正常細(xì)胞的骨架結(jié)構(gòu)。結(jié)論:高糖激活腹膜間皮細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR通路的激活;Rho GTPases通過調(diào)節(jié) stress fiber、focal adhesion、lamellipodia、filopodia進(jìn)而影響腹膜間皮細(xì)胞的 EMT,雷帕霉素通過抑制Rho GTPases的活化逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的腹膜間皮細(xì)胞EMT。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R572.2;R692.5

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 Wen-Ning Li;Jia-Li Wei;Ming Wu;Wei Wu;Yun Huang;Mao-Wei Xie;Hui Han;;AEG-1 participates in high glucose-induced activation of Rho kinase and epithelial-mesenchymal transition in proximal tubular epithelial cells[J];Asian Pacific Journal of Tropical Medicine;2015年12期

，

本文編號：1313722