本文關(guān)鍵詞：過表達(dá)Beclin 1誘導(dǎo)的自噬提高了MG63對(duì)Gemcitabine的抵抗與Wnt信號(hào)通路關(guān)系的研究　出處：《青島大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的:Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路異常與大多數(shù)腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān),但Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路在抗腫瘤化療藥物抵抗方面的作用機(jī)制仍不清楚。通過研究Beclin 1基因過表達(dá)在MG63骨肉瘤細(xì)胞自噬以及MG63骨肉瘤細(xì)胞對(duì)Gemcitabine的抵抗中的作用,和Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路在MG63骨肉瘤細(xì)胞自噬中的作用,探討Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路與Beclin 1基因過表達(dá)MG63骨肉瘤細(xì)胞對(duì)Gemcitabine的抵抗之間的關(guān)系。方法:1.MG63骨肉瘤細(xì)胞培養(yǎng)用DMEM培養(yǎng)液加上10%滅活的胎牛血清,在含有5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)MG63骨肉瘤細(xì)胞,待細(xì)胞約90%融合時(shí),在生物安全柜中進(jìn)行細(xì)胞傳代。加入少許0.125%胰蛋白酶和0.02%EDTA,消化3-5分鐘,倒置顯微鏡下觀察到胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大時(shí),完全培養(yǎng)基終止消化,離心去上清(1000 rpm),按1:3比例進(jìn)行細(xì)胞傳代。2.共焦熒光顯微鏡監(jiān)測自噬將Ds Red-LC3-GFP連接到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上,與輔助質(zhì)粒Gag-pol和VSVG一起共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,收集病毒上清后感染靶細(xì)胞。經(jīng)Puromycin篩選后,建立穩(wěn)定表達(dá)Ds Red-LC3-GFP的細(xì)胞株。用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)293T細(xì)胞3天做為陽性對(duì)照組觀察自噬的發(fā)生。在共焦熒光顯微鏡下觀察靶細(xì)胞熒光表達(dá)情況,沒有發(fā)生自噬時(shí),Ds RED紅光和GFP綠光都有表達(dá),發(fā)生自噬時(shí),主要表現(xiàn)為Ds RED紅光為主。3.Western blot檢測在細(xì)胞蛋白抽提開始前加入0.1mol/L PMSF,1×106細(xì)胞用PBS洗兩次,用含有0.1mol/L PMSF的裂解液孵育。細(xì)胞裂解物13000rpm,4℃離心20min。梯度稀釋BSA標(biāo)準(zhǔn)品,配制濃度為20-2000μg/m L的待測樣品。配制BCA溶液,顯色反應(yīng)30min,562nm測定標(biāo)準(zhǔn)液和樣品的吸光度,平行測三次,計(jì)算待測樣品濃度。根據(jù)待檢測蛋白的分子量,配制10%的分離膠,濃縮膠濃度為4%。取待檢測蛋白樣品20μL上樣,進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)0.45μm孔徑NC膜1小時(shí),將膜完全浸沒在5%脫脂奶粉-TBST中室溫輕搖1小時(shí),一抗(anti-Beclin 1和anti-LC3B)室溫孵育10min,放4℃過夜,第二天取膜,在室溫孵育30min,TBST洗膜5次,3min/次,用HRP標(biāo)記的山羊抗兔Ig G(H+L),室溫下輕搖40min,TBST洗膜6次,3min/次。配制ECL溶液,將其滴加到膜上,室溫下避光反應(yīng)3-5min,選擇不等時(shí)間多次膠片曝光,顯影1-2min,定影。4.PCR檢測Caspase 3、Caspase 7、BCL-2、cyclin D1、c-FLIP的表達(dá)取貼壁培養(yǎng)的呈對(duì)數(shù)生長的MG63骨肉瘤細(xì)胞約0.5×106個(gè),培養(yǎng)12小時(shí)后分別給予Gem(10μg/m L)、Gem(50μg/m L)、Beclin 1+Gem(10μg/m L)、Beclin 1+Gem(50μg/m L)處理,并設(shè)立空白對(duì)照組。培養(yǎng)24小時(shí)后,用0.125%的胰蛋白酶消化后,PBS洗滌2次,用TRIZOL試劑提取細(xì)胞總RNA,根據(jù)操作說明合成c DNA。根據(jù)Promega公司的M-MLV操作說明書進(jìn)行總RNA逆轉(zhuǎn)錄。5.PCR檢測ATG4、Beclin 1、LAMP1、ATG5、ATG12的表達(dá)選取對(duì)數(shù)生長期的MG63骨肉瘤細(xì)胞約0.5×106個(gè),培養(yǎng)12小時(shí)后分別給予Wnt3a(200ng/m L)、XAV939(1μmol/L)處理,設(shè)對(duì)照組。依次進(jìn)行細(xì)胞總RNA的提取、c DNA的合成、總RNA逆轉(zhuǎn)錄以及檢測基因引物探針的設(shè)計(jì)(方法同4)。6.流式細(xì)胞儀檢測將MG63骨肉瘤細(xì)胞以1×106接種于6孔板,培養(yǎng)72小時(shí)后進(jìn)行消化,使細(xì)胞形成單細(xì)胞懸液,2000rpm離心5min,棄去上清,用預(yù)冷的PBS洗滌2次。用100μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,加入5μL Annexin-V染色液和5μL PI染色液,室溫下避光孵育20分鐘,以流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。7.ELISA技術(shù)分析beclin 1在MG63骨肉瘤細(xì)胞上清的水平取10μL細(xì)胞上清液用0.05mol/L Na HCO3稀釋到100μL包被ELISA板,室溫下振蕩1.5小時(shí)。PBST洗板3次,加封閉液(PBST加1%脫脂奶粉)350μL/孔,室溫下放置1小時(shí),PBST洗3次。加封閉液稀釋的胃蛋白酶原一抗100μL/孔,ELISA板于室溫振蕩1小時(shí),PBST洗3次。加封閉液稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗100μL/孔,ELISA板于室溫振蕩1小時(shí),PBST洗3次。加入OPD顯色液100μL/孔,避光反應(yīng)約10-30分鐘。1mol/L H2SO4 100μL/孔終止反應(yīng),酶標(biāo)儀測OD450nm。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間整體比較采用單因素/雙因素方差分析,進(jìn)一步采用LSD法進(jìn)行兩兩比較檢驗(yàn)。所有分析均在SPSS16.0軟件中完成,以p0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1.過表達(dá)Beclin 1基因可誘發(fā)MG63骨肉瘤細(xì)胞自噬的發(fā)生過表達(dá)Beclin 1基因的MG63骨肉瘤細(xì)胞蛋白條帶明顯,而對(duì)照組細(xì)胞未見明顯蛋白條帶,差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),表明在MG63骨肉瘤細(xì)胞中成功的過表達(dá)了Beclin 1基因。過表達(dá)Beclin 1基因的MG63骨肉瘤細(xì)胞其LC3B-Ⅱ蛋白條帶較對(duì)照組明顯,差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01),表明LC3B發(fā)生剪切,即自噬增加。2.Beclin 1過表達(dá)后可減少Gemcitabine誘導(dǎo)的MG63骨肉瘤細(xì)胞凋亡Gemcitabine可誘導(dǎo)凋亡相關(guān)基因(Caspase 3、Caspase 7)的表達(dá),下調(diào)抗凋亡基因(BCL-2,cyclin D1和c-FLIP)的表達(dá),且呈劑量依賴性。Beclin 1基因過表達(dá)后會(huì)逆轉(zhuǎn)上述過程,減少凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。3.激活Wnt信號(hào)通路可降低MG63骨肉瘤細(xì)胞自噬,抑制可促進(jìn)自噬激活Wnt信號(hào)通路可降低自噬,抑制Wnt信號(hào)通路可促進(jìn)自噬。抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路可顯著增加Beclin 1基因的表達(dá),表明Beclin 1基因的表達(dá)可能在Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制自噬方面起一定的作用。4.激活Wnt信號(hào)通路可降低自噬,減少Beclin 1基因過表達(dá)MG63骨肉瘤細(xì)胞對(duì)Gemcitabine的抵抗Gemcitabine可以誘導(dǎo)MG63骨肉瘤細(xì)胞凋亡,Beclin 1基因過表達(dá)MG63骨肉瘤細(xì)胞可減少Gemcitabine誘導(dǎo)的凋亡,激活Wnt信號(hào)通路可降低自噬,增加Beclin1基因過表達(dá)MG63骨肉瘤細(xì)胞凋亡,從而減少Beclin 1基因過表達(dá)骨肉瘤細(xì)胞對(duì)Gemcitabine的抵抗。應(yīng)用Gemcitabine處理的Beclin 1基因過表達(dá)MG63骨肉瘤細(xì)胞存活率呈劑量依賴性下降,在應(yīng)用Gem(40μg/m L)和Gem(60μg/m L)處理的Beclin 1基因過表達(dá)MG63骨肉瘤細(xì)胞中加用Wnt3a(200ng/m L)可明顯降低細(xì)胞存活率,差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01),而加用XAV939(1μmol/L)可明顯提升細(xì)胞存活率,差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路通過下調(diào)Beclin 1基因的表達(dá)抑制MG63骨肉瘤細(xì)胞的自噬,降低Gemcitabine誘導(dǎo)的MG63骨肉瘤細(xì)胞凋亡。結(jié)論:Beclin 1基因過表達(dá)可誘發(fā)MG63骨肉瘤細(xì)胞自噬的發(fā)生,并減少Gemcitabine誘導(dǎo)的MG63骨肉瘤細(xì)胞凋亡。Beclin 1過表達(dá)后可減少Gemcitabine誘導(dǎo)的凋亡,但Wnt信號(hào)通路激活可反向抑制。我們的研究結(jié)果為解決抗腫瘤化療藥物耐藥性的問題提供了一個(gè)新的見解。Wnt/β-catenin信號(hào)通路異�？梢源龠M(jìn)Beclin1介導(dǎo)自噬,從而阻止化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。我們的研究結(jié)果為通過調(diào)節(jié)異常Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)自噬和自噬基因Beclin 1,提高化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的敏感性提供了一種潛在的證據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R738

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本文編號(hào)：1313417