本文關(guān)鍵詞：甲基化、乙�；揎椄淖儗�(duì)食管癌細(xì)胞生長(zhǎng)及相關(guān)基因表達(dá)的研究　出處：《新疆醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的:1)在食管癌Eca109和KYSE150細(xì)胞中改變表觀遺傳學(xué)修飾并檢測(cè)該修飾對(duì)食管癌細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡變化的影響,為今后臨床食管癌使用TSA和5-Aza-dC的藥物治療奠定前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ);2)以PTEN、Survivin和IKKα/IKKβ為抑癌基因、癌基因和腫瘤轉(zhuǎn)移基因(癌基因)的代表,觀察TSA和5-Aza-dC對(duì)靶基因甲基化和細(xì)胞內(nèi)乙�；淖饔�;深入觀察低甲基化聯(lián)合高乙�；慕Y(jié)果。探討食管癌發(fā)生中癌基因、抑癌基因和腫瘤轉(zhuǎn)移基因(癌基因)的甲基化和乙�；揎椀目赡嫘�、不一致性和甲基化聯(lián)合乙酰化的交互作用結(jié)果;3)將靶基因表觀遺傳學(xué)修飾改變、表達(dá)異常和食管癌發(fā)生相關(guān)聯(lián),探究在食管癌中改變表觀遺傳學(xué)修飾對(duì)癌基因、抑癌基因和腫瘤轉(zhuǎn)移基因(癌基因)表達(dá)的影響,為臨床食管癌的早期發(fā)現(xiàn)和診治提供分子檢測(cè)指標(biāo)。方法:1)以人食管鱗狀上皮細(xì)胞癌Eca109和KYSE150為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?設(shè)置藥物TSA和5-Aza-dC的梯度作用濃度和時(shí)間(TSA為0.08μMol/L、0.4μMol/L、2μMol/L、10μMol/L和50μMol/L;5-Aza-dC為0.2μMol/L、1μMol/L、5μMol/L、25μMol/L和125μMol/L,作用時(shí)間為12h、24h和48h),采用CCK-8試劑盒檢測(cè),繪制生長(zhǎng)曲線并使用公式計(jì)算其抑制率,選擇藥物最佳作用濃度及時(shí)間;設(shè)立正常對(duì)照組、TSA組、5-Aza-dC組和聯(lián)合用藥組,運(yùn)用細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡檢測(cè)指標(biāo)驗(yàn)證TSA和5-Aza-dC對(duì)食管癌細(xì)胞是否產(chǎn)生了藥物作用,分析比較在不同實(shí)驗(yàn)分組中各個(gè)指標(biāo)的變化特點(diǎn);2)根據(jù)課題組前期研究結(jié)果[130-131,187](即食管癌中篩選差異表達(dá)基因),選擇PTEN、Survivin、IKKα和IKKβ作為靶基因,從表觀遺傳學(xué)角度進(jìn)行檢測(cè):①甲基化檢測(cè),找到目標(biāo)基因啟動(dòng)子上游2000bp左右的堿基序列,使用http://cpgislands.usc.edu/和http://www.urogene.org/cgi-bin/Methrimer/Methprimer.cgi軟件觀察堿基序列中CG分布及甲基化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)情況。根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果從中選擇富含CG島的堿基區(qū)段作為受試對(duì)象設(shè)計(jì)甲基化引物;提取實(shí)驗(yàn)各組樣本的基因組DNA并行BSP法處理;以BSP法處理過的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增并TA克隆測(cè)序,用軟件將測(cè)序結(jié)果與原序列對(duì)比得出甲基化分布黑白散點(diǎn)圖,計(jì)算甲基化頻率,分析比較變化特點(diǎn);②乙�；瘷z測(cè),抽提樣本細(xì)胞核內(nèi)的hdac,根據(jù)hdac活性檢測(cè)試劑盒操作提示,建立標(biāo)準(zhǔn)品曲線,使用酶標(biāo)儀獲得吸光光度數(shù)值,代入公式計(jì)算hdac的相對(duì)含量,各組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并比較變化特點(diǎn);3)轉(zhuǎn)錄和翻譯水檢測(cè):real-timepcr技術(shù)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組中靶基因的mrna表達(dá)情況;westernblot檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組中靶基因的蛋白表達(dá)情況;結(jié)合第二部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果,將上述指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析,驗(yàn)證甲基化、乙酰化和甲基化+乙�；饔脤�(duì)靶基因在食管癌中表達(dá)的影響及可能存在的相互調(diào)控關(guān)系。結(jié)果:1)細(xì)胞學(xué)各項(xiàng)結(jié)果顯示:①tsa和5-aza-dc在48h對(duì)eca109細(xì)胞的有效藥物作用濃度為2μmol/l和5μmol/l。eca109細(xì)胞對(duì)兩類藥物表現(xiàn)出隨藥物強(qiáng)度增加和作用時(shí)間延長(zhǎng)出現(xiàn)的生長(zhǎng)抑制,其中tsa作用更顯著(p0.05);②超微結(jié)構(gòu)改變常常會(huì)早于細(xì)胞大體形態(tài)改變,且聯(lián)合用藥比單獨(dú)用tsa或5-aza-dc產(chǎn)生破壞細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)作用更明顯;③單獨(dú)用藥和聯(lián)合用藥都可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡,其中tsa和聯(lián)合用藥促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用顯著(p0.05);kyse150細(xì)胞對(duì)不同分組藥物的敏感性弱于eca109細(xì)胞。④單獨(dú)用藥和聯(lián)合用藥可以使兩類細(xì)胞被阻滯于細(xì)胞周期的不同時(shí)限內(nèi)。tsa可阻滯eca109細(xì)胞于g0/g1期和g2/m期、阻滯kyse150細(xì)胞于g2/m期;5-aza-dc阻滯兩類細(xì)胞于s期;聯(lián)合用藥組阻滯兩類細(xì)胞于g2/m期。2)甲基化和乙�；瘷z測(cè):①抑癌基因pten啟動(dòng)子區(qū)域甲基化頻率較高,使用5-aza-dc后甲基化頻率降低(p0.01),聯(lián)合tsa用藥后甲基化頻率降低明顯(p0.01);癌基因survivin啟動(dòng)子區(qū)域甲基化頻率較低,使用藥物干預(yù)后甲基化頻率降低不明顯;腫瘤轉(zhuǎn)移基因(癌基因)ikkα和ikkβ啟動(dòng)子區(qū)域甲基化頻率較survivin高,但低于pten;使用5-aza-dc后甲基化頻率降低(p0.05),聯(lián)合tsa用藥后甲基化頻率降低明顯(p0.01)。②不同食管癌中hdac濃度含量不一致,tsa作用后可有效降低細(xì)胞核內(nèi)hdac含量,聯(lián)合5-aza-dc并沒有出現(xiàn)顯著降低hdac的作用。3)靶基因表達(dá):①抑癌基因pten:mrna和蛋白在不同類型食管癌中的表達(dá)較為一致;tsa或5-aza-dc均有助于食管癌中pten表達(dá)升高,兩藥聯(lián)合作用后表達(dá)則顯著增高(p0.01);相關(guān)性分析顯示其甲基化改變與mrna負(fù)相關(guān)(p0.01),與蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)(無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義);乙酰化改變與mrna有負(fù)相關(guān)趨勢(shì)(無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義),與蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(p0.05)。②癌基因survivin:mrna在不同類型食管癌中的表達(dá)較為一致,蛋白表達(dá)在eca109中高于kyse150(p0.05);tsa和5-aza-dc分別可以抑制食管癌中survivin的高表達(dá),兩藥聯(lián)合作用后表達(dá)進(jìn)一步被抑制,相關(guān)性分析顯示甲基化和乙�；淖兣csurvivin表達(dá)呈正相關(guān)趨勢(shì),相關(guān)性較低。③腫瘤轉(zhuǎn)移基因(癌基因)ikkα/ikkβ:mrna在不同類食管癌中的表達(dá)較為一致,ikkα蛋白表達(dá)在kyse150中較高,ikkβ蛋白表達(dá)在eca109中較高;tsa和5-aza-dc分別可以抑制食管癌中ikkα/ikkβ的高表達(dá),兩藥聯(lián)合作用后表達(dá)進(jìn)一步被抑制(p0.01),相關(guān)性分析顯示乙�；淖兣cIKKα表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P0.05),相關(guān)性較高,甲基化頻率與其有正相關(guān)趨勢(shì),但相關(guān)系數(shù)較低;甲基化頻率和HDAC濃度的改變與IKKβ有正相關(guān)趨勢(shì),但是相關(guān)性較低。結(jié)論:1)TSA和5-Aza-d C在抑制食管癌細(xì)胞生長(zhǎng)方面存在差異,單獨(dú)用藥和聯(lián)合用藥對(duì)食管癌細(xì)胞生長(zhǎng)影響不同,說明TSA主導(dǎo)的增高乙�；�5-Aza-dC主導(dǎo)的降低甲基化及二者聯(lián)合作用對(duì)食管癌細(xì)胞的生長(zhǎng)有阻礙作用,這為今后用表觀遺傳學(xué)理論指導(dǎo)臨床用藥提供治療參考;2)以PTEN、Survivin和IKKα/IKKβ為代表的抑癌基因、癌基因和腫瘤轉(zhuǎn)移基因(癌基因)在食管鱗狀細(xì)胞癌中的甲基化修飾程度不同,本研究顯示抑癌基因PTEN腫瘤轉(zhuǎn)移基因(癌基因)IKKα/IKKβ癌基因Survivin;在上述三類基因中,5-Aza-dC可有效的產(chǎn)生去甲基化作用,但TSA不能夠顯著改變啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀態(tài),聯(lián)合用藥時(shí)TSA有助于5-Aza-dC去甲基化作用增強(qiáng);3)不同類型食管癌細(xì)胞中,乙�；揎棾潭炔灰恢麦w現(xiàn)在HDAC的濃度上。TSA可以有效地降低細(xì)胞內(nèi)HDAC含量,聯(lián)合去甲基化作用后并不增強(qiáng)TSA產(chǎn)生的提高乙�；饔�;4)改變表觀遺傳學(xué)對(duì)食管鱗狀上皮細(xì)胞癌修飾結(jié)果導(dǎo)致靶基因在mRNA和蛋白水平有不同程度的表達(dá)升高或抑制,具體是抑癌基因PTEN甲基化降低、乙�；叽龠M(jìn)該基因表達(dá);癌基因Survivin經(jīng)藥物作用后表觀遺傳學(xué)修飾改變不明顯,但最終該基因表達(dá)有改變,可能是受到PTEN和IKKα/IKKβ局部調(diào)控作用;IKKα甲基化降低、乙�；咭种圃摶虻谋磉_(dá);IKKβ甲基化降低,乙�；咭种圃摶虮磉_(dá)。以甲基化和乙�；癁橹鞯谋碛^遺傳學(xué)修飾改變可能更多的參與了PTEN和IKKα/IKKβ的表達(dá)調(diào)控,而直接未參與調(diào)節(jié)Survivin的表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：新疆醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.1

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 滕飛;陳東;商建峰;王偉;肖磊;李彥瑋;;食管鱗狀細(xì)胞癌并發(fā)食管胃腸間質(zhì)瘤臨床病理觀察[J];診斷病理學(xué)雜志;2012年03期

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本文編號(hào)：1313293