本文關鍵詞：甲基化、乙�；揎椄淖儗κ彻馨┘毎L及相關基因表達的研究　出處：《新疆醫(yī)科大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：目的:1)在食管癌Eca109和KYSE150細胞中改變表觀遺傳學修飾并檢測該修飾對食管癌細胞形態(tài)、細胞周期和細胞凋亡變化的影響,為今后臨床食管癌使用TSA和5-Aza-dC的藥物治療奠定前期實驗基礎;2)以PTEN、Survivin和IKKα/IKKβ為抑癌基因、癌基因和腫瘤轉(zhuǎn)移基因(癌基因)的代表,觀察TSA和5-Aza-dC對靶基因甲基化和細胞內(nèi)乙�；淖饔�;深入觀察低甲基化聯(lián)合高乙�；慕Y果。探討食管癌發(fā)生中癌基因、抑癌基因和腫瘤轉(zhuǎn)移基因(癌基因)的甲基化和乙�；揎椀目赡嫘浴⒉灰恢滦院图谆�(lián)合乙�；慕换プ饔媒Y果;3)將靶基因表觀遺傳學修飾改變、表達異常和食管癌發(fā)生相關聯(lián),探究在食管癌中改變表觀遺傳學修飾對癌基因、抑癌基因和腫瘤轉(zhuǎn)移基因(癌基因)表達的影響,為臨床食管癌的早期發(fā)現(xiàn)和診治提供分子檢測指標。方法:1)以人食管鱗狀上皮細胞癌Eca109和KYSE150為實驗模型,設置藥物TSA和5-Aza-dC的梯度作用濃度和時間(TSA為0.08μMol/L、0.4μMol/L、2μMol/L、10μMol/L和50μMol/L;5-Aza-dC為0.2μMol/L、1μMol/L、5μMol/L、25μMol/L和125μMol/L,作用時間為12h、24h和48h),采用CCK-8試劑盒檢測,繪制生長曲線并使用公式計算其抑制率,選擇藥物最佳作用濃度及時間;設立正常對照組、TSA組、5-Aza-dC組和聯(lián)合用藥組,運用細胞形態(tài)學觀察、細胞周期和細胞凋亡檢測指標驗證TSA和5-Aza-dC對食管癌細胞是否產(chǎn)生了藥物作用,分析比較在不同實驗分組中各個指標的變化特點;2)根據(jù)課題組前期研究結果[130-131,187](即食管癌中篩選差異表達基因),選擇PTEN、Survivin、IKKα和IKKβ作為靶基因,從表觀遺傳學角度進行檢測:①甲基化檢測,找到目標基因啟動子上游2000bp左右的堿基序列,使用http://cpgislands.usc.edu/和http://www.urogene.org/cgi-bin/Methrimer/Methprimer.cgi軟件觀察堿基序列中CG分布及甲基化位點的預測情況。根據(jù)預測結果從中選擇富含CG島的堿基區(qū)段作為受試對象設計甲基化引物;提取實驗各組樣本的基因組DNA并行BSP法處理;以BSP法處理過的DNA為模板進行PCR擴增并TA克隆測序,用軟件將測序結果與原序列對比得出甲基化分布黑白散點圖,計算甲基化頻率,分析比較變化特點;②乙�；瘷z測,抽提樣本細胞核內(nèi)的hdac,根據(jù)hdac活性檢測試劑盒操作提示,建立標準品曲線,使用酶標儀獲得吸光光度數(shù)值,代入公式計算hdac的相對含量,各組進行統(tǒng)計分析并比較變化特點;3)轉(zhuǎn)錄和翻譯水檢測:real-timepcr技術檢測各實驗組中靶基因的mrna表達情況;westernblot檢測各實驗組中靶基因的蛋白表達情況;結合第二部分實驗結果,將上述指標進行相關性分析,驗證甲基化、乙�；图谆�+乙�；饔脤Π谢蛟谑彻馨┲斜磉_的影響及可能存在的相互調(diào)控關系。結果:1)細胞學各項結果顯示:①tsa和5-aza-dc在48h對eca109細胞的有效藥物作用濃度為2μmol/l和5μmol/l。eca109細胞對兩類藥物表現(xiàn)出隨藥物強度增加和作用時間延長出現(xiàn)的生長抑制,其中tsa作用更顯著(p0.05);②超微結構改變常常會早于細胞大體形態(tài)改變,且聯(lián)合用藥比單獨用tsa或5-aza-dc產(chǎn)生破壞細胞超微結構作用更明顯;③單獨用藥和聯(lián)合用藥都可以促進細胞凋亡,其中tsa和聯(lián)合用藥促進細胞凋亡作用顯著(p0.05);kyse150細胞對不同分組藥物的敏感性弱于eca109細胞。④單獨用藥和聯(lián)合用藥可以使兩類細胞被阻滯于細胞周期的不同時限內(nèi)。tsa可阻滯eca109細胞于g0/g1期和g2/m期、阻滯kyse150細胞于g2/m期;5-aza-dc阻滯兩類細胞于s期;聯(lián)合用藥組阻滯兩類細胞于g2/m期。2)甲基化和乙�；瘷z測:①抑癌基因pten啟動子區(qū)域甲基化頻率較高,使用5-aza-dc后甲基化頻率降低(p0.01),聯(lián)合tsa用藥后甲基化頻率降低明顯(p0.01);癌基因survivin啟動子區(qū)域甲基化頻率較低,使用藥物干預后甲基化頻率降低不明顯;腫瘤轉(zhuǎn)移基因(癌基因)ikkα和ikkβ啟動子區(qū)域甲基化頻率較survivin高,但低于pten;使用5-aza-dc后甲基化頻率降低(p0.05),聯(lián)合tsa用藥后甲基化頻率降低明顯(p0.01)。②不同食管癌中hdac濃度含量不一致,tsa作用后可有效降低細胞核內(nèi)hdac含量,聯(lián)合5-aza-dc并沒有出現(xiàn)顯著降低hdac的作用。3)靶基因表達:①抑癌基因pten:mrna和蛋白在不同類型食管癌中的表達較為一致;tsa或5-aza-dc均有助于食管癌中pten表達升高,兩藥聯(lián)合作用后表達則顯著增高(p0.01);相關性分析顯示其甲基化改變與mrna負相關(p0.01),與蛋白表達呈負相關趨勢(無統(tǒng)計學意義);乙�；淖兣cmrna有負相關趨勢(無統(tǒng)計學意義),與蛋白表達呈負相關(p0.05)。②癌基因survivin:mrna在不同類型食管癌中的表達較為一致,蛋白表達在eca109中高于kyse150(p0.05);tsa和5-aza-dc分別可以抑制食管癌中survivin的高表達,兩藥聯(lián)合作用后表達進一步被抑制,相關性分析顯示甲基化和乙�；淖兣csurvivin表達呈正相關趨勢,相關性較低。③腫瘤轉(zhuǎn)移基因(癌基因)ikkα/ikkβ:mrna在不同類食管癌中的表達較為一致,ikkα蛋白表達在kyse150中較高,ikkβ蛋白表達在eca109中較高;tsa和5-aza-dc分別可以抑制食管癌中ikkα/ikkβ的高表達,兩藥聯(lián)合作用后表達進一步被抑制(p0.01),相關性分析顯示乙酰化改變與IKKα表達呈負相關(P0.05),相關性較高,甲基化頻率與其有正相關趨勢,但相關系數(shù)較低;甲基化頻率和HDAC濃度的改變與IKKβ有正相關趨勢,但是相關性較低。結論:1)TSA和5-Aza-d C在抑制食管癌細胞生長方面存在差異,單獨用藥和聯(lián)合用藥對食管癌細胞生長影響不同,說明TSA主導的增高乙�；�5-Aza-dC主導的降低甲基化及二者聯(lián)合作用對食管癌細胞的生長有阻礙作用,這為今后用表觀遺傳學理論指導臨床用藥提供治療參考;2)以PTEN、Survivin和IKKα/IKKβ為代表的抑癌基因、癌基因和腫瘤轉(zhuǎn)移基因(癌基因)在食管鱗狀細胞癌中的甲基化修飾程度不同,本研究顯示抑癌基因PTEN腫瘤轉(zhuǎn)移基因(癌基因)IKKα/IKKβ癌基因Survivin;在上述三類基因中,5-Aza-dC可有效的產(chǎn)生去甲基化作用,但TSA不能夠顯著改變啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài),聯(lián)合用藥時TSA有助于5-Aza-dC去甲基化作用增強;3)不同類型食管癌細胞中,乙�；揎棾潭炔灰恢麦w現(xiàn)在HDAC的濃度上。TSA可以有效地降低細胞內(nèi)HDAC含量,聯(lián)合去甲基化作用后并不增強TSA產(chǎn)生的提高乙�；饔�;4)改變表觀遺傳學對食管鱗狀上皮細胞癌修飾結果導致靶基因在mRNA和蛋白水平有不同程度的表達升高或抑制,具體是抑癌基因PTEN甲基化降低、乙�；叽龠M該基因表達;癌基因Survivin經(jīng)藥物作用后表觀遺傳學修飾改變不明顯,但最終該基因表達有改變,可能是受到PTEN和IKKα/IKKβ局部調(diào)控作用;IKKα甲基化降低、乙�；咭种圃摶虻谋磉_;IKKβ甲基化降低,乙�；咭种圃摶虮磉_。以甲基化和乙酰化為主的表觀遺傳學修飾改變可能更多的參與了PTEN和IKKα/IKKβ的表達調(diào)控,而直接未參與調(diào)節(jié)Survivin的表達。
【學位授予單位】：新疆醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.1

【參考文獻】

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1 滕飛;陳東;商建峰;王偉;肖磊;李彥瑋;;食管鱗狀細胞癌并發(fā)食管胃腸間質(zhì)瘤臨床病理觀察[J];診斷病理學雜志;2012年03期

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本文編號：1313293