本文關(guān)鍵詞：Fibulin-3在高血壓血管重構(gòu)的表達(dá)及意義研究　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：高血壓病是嚴(yán)重危害人類健康的常見心血管疾病之一,高血壓可引起血管結(jié)構(gòu)和功能的改變,即高血壓血管重構(gòu),可促進(jìn)高血壓進(jìn)展和心血管致殘率和死亡率升高。目前,對(duì)于高血壓血管重構(gòu)的發(fā)病機(jī)制仍不明確,并且如何預(yù)防與逆轉(zhuǎn)血管重構(gòu),已成為目前抗高血壓治療及預(yù)防高血壓并發(fā)癥的重要課題。血管重構(gòu)被認(rèn)為最早也是最廣泛的高血壓靶器官損害。動(dòng)脈結(jié)構(gòu)和功能的重構(gòu)性變化既是高血壓病血液動(dòng)力學(xué)紊亂、神經(jīng)體液變化和局部內(nèi)分泌因素改變的適應(yīng)性反應(yīng),又是高血壓病發(fā)展惡化及心腦腎等其他靶器官損害的重要病理基礎(chǔ)。因此,探討高血壓血管重構(gòu)的發(fā)生機(jī)制以逆轉(zhuǎn)血管重構(gòu)是防治高血壓及其靶器官損害的關(guān)鍵所在。血管壁細(xì)胞外基質(zhì)(vascular extracellular matrix,ECM)是存在于組織細(xì)胞表面或細(xì)胞之間的一組蛋白大分子,主要包括膠原蛋白、非膠原糖蛋白和蛋白多糖,受多種細(xì)胞因子及酶調(diào)節(jié),其組成處于動(dòng)態(tài)變化之中。血管重構(gòu)典型的特征包括ECM增多和成分的改變。基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)是降解ECM成分的最主要蛋白水解系統(tǒng),金屬蛋白酶組織抑制因子(Tissue inhibitors of metalloproteinases,TIMPs)是基質(zhì)金屬蛋白酶的內(nèi)源性特異性抑制因子,通過與MMPs的催化區(qū)域結(jié)合,阻止MMPs與底物結(jié)合而調(diào)節(jié)MMPs活性。生理狀態(tài)下,MMPs/TIMPs保持相對(duì)平衡,膠原蛋白結(jié)構(gòu)、功能正常。動(dòng)脈血管細(xì)胞外基質(zhì)的變化是動(dòng)脈血管重構(gòu)的本質(zhì),細(xì)胞外基質(zhì)的變化可以導(dǎo)致動(dòng)脈彈力纖維降解及膠原成份的改變,使動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)及功能異常。Fibulins是一個(gè)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白家族,參與ECM結(jié)構(gòu)的合成與穩(wěn)定,其主要功能是形成和穩(wěn)定基膜、彈性纖維和疏松結(jié)締組織。自發(fā)現(xiàn)第一個(gè)Fibulin-1以來,已經(jīng)分離出了7個(gè)成員,Fibulin-3和Fibulin-4,5同屬于Fibulins蛋白家族中第二亞組成員,分子結(jié)構(gòu)細(xì)小(50-60 kDa)和有著高度同源性,它們都含有特征性的串聯(lián)排列的Ca2+結(jié)合表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域和C-末端fibulin結(jié)構(gòu)域。研究發(fā)現(xiàn),在Fibulins家族中,Fibulin-1與血管硬化存在相關(guān)性,Fibulin-4在彈性纖維的形成以及平滑肌細(xì)胞在動(dòng)脈壁的終端分化和成熟起著雙重作用,對(duì)主動(dòng)脈損傷起著修復(fù)作用,Fibulin-5與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生以及血管氧化應(yīng)激過程相關(guān)聯(lián)。目前對(duì)于Fibulin-3的研究,主要集中在腫瘤和盆腔支持組織間質(zhì)中細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的聚集和穩(wěn)定過程,尚未見Fibulin-3在血管,特別是對(duì)大動(dòng)脈細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)方面的報(bào)道。已發(fā)現(xiàn)Fibulin-3與TIMP-3較強(qiáng)的相互作用,能刺激TIMP-1和TIMP-3的表達(dá),抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-2、MMP-3和MMP-9)的表達(dá)；在Fibulin-3水平下降或基因沉默情況下,隨著Fibulin-3的降低,TIMP-3表達(dá)水平降低,對(duì)MMPs的抑制作用減弱,MMPs活性增強(qiáng),導(dǎo)致MMPs/TIMPs失衡,引起腫瘤和盆腔支持組織間質(zhì)中細(xì)胞外間質(zhì)重構(gòu),導(dǎo)致腫瘤早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和壓力性尿失禁的發(fā)生。因?yàn)樵谘苤蠱MPs/TIMPs的水平變化影響ECM的穩(wěn)定和血管結(jié)構(gòu)和功能的變化,那么,Fibulin-3是否能夠產(chǎn)生對(duì)MMPs/TIMPs的影響,繼而影響動(dòng)脈壁ECM的成份變化和纖維蛋白的含量和結(jié)構(gòu)呢?目前,尚未見Fibulin-3在血管性疾病方面,特別是高血壓血管重構(gòu)的研究報(bào)道。為此,我們設(shè)想Fibulin-3對(duì)MMPs、TIMP-3、ECM的影響同樣存在于高血壓動(dòng)脈基質(zhì)中,并且對(duì)血管纖維的結(jié)構(gòu)改變存在重要影響,與高血壓病程的發(fā)展存在相關(guān)性。這對(duì)研究高血壓血管重構(gòu)的損傷和／或修復(fù)機(jī)制有著重大意義。第一章Fibulin-3在自發(fā)性高血壓大鼠胸主動(dòng)脈中的表達(dá)及與基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制因子的相關(guān)性目的：Fibulin-3作為細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,參與細(xì)胞外基質(zhì)(vascular extracellular matrix,ECM)的合成與穩(wěn)定,本研究主要探討Fibulin-3及基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrixmetalloproteinases, MMPs)和金屬蛋白酶組織抑制因子-3 (Tissue inhibitors of metalloproteinases,TIMP-3)在自發(fā)性高血壓大鼠血管重構(gòu)中的表達(dá)及相關(guān)性。方法；選擇8周齡和16周齡的雄性自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats, SHR)為實(shí)驗(yàn)組；同周齡健康Wistar京都(WKY)大鼠為對(duì)照組；所有大鼠均購買于北京維通利華公司,合格證書號(hào)：SCXK(滬2003-0003)。經(jīng)腹腔注射3%戊巴比妥鈉(50mg/kg)麻醉處死,解剖,取出胸主動(dòng)脈作為研究對(duì)象。胸主動(dòng)脈經(jīng)蘇木素-伊紅(H-E)染色分析血管壁病理改變：包括主動(dòng)脈血管壁厚度(中-內(nèi)膜厚度)和血管壁厚度/管腔比值；運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色和Western blot蛋白電泳分析胸主動(dòng)脈Fibulin-3、MMP-2、MMP-9、TIMP-3蛋白水平表達(dá)；采用Real-time PCR (RT-PCR)檢測胸主動(dòng)脈Fibulin-3、MMP-2、MMP-9的mRNA水平表達(dá)；運(yùn)用Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)免疫組化染色切片進(jìn)行灰度定量檢測。結(jié)果：在16周齡的SHR中,大鼠血壓(收縮壓,222±14.66mmHg)顯著升高,顯著高于其他3組[8周齡SHR大鼠(142±8.89 mmHg),8周齡WKY大鼠(118±14.3mmHg)和16周齡WKY大鼠(120±8.5mmHg)],差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)；可見胸主動(dòng)脈出現(xiàn)管壁增厚(97.80±5.39um),血管壁/腔比值增大,達(dá)(7.95±0.37)%,與其他3組比較,差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001),光鏡下可見血管平滑肌細(xì)胞排列紊亂,細(xì)胞體積粗大,數(shù)量減少,出現(xiàn)血管重構(gòu)；而8周齡SHR組和8周齡WKY大鼠組及16周齡WKY大鼠組血管壁病理改變并不顯著。進(jìn)一步通過免疫組化、western blot檢測胸主動(dòng)脈Fibulin-3、MMP-2、 MMP-9、TIMP-3蛋白的表達(dá),顯示16周齡的SHR胸主動(dòng)脈Fibulin-3、MMP-2、 MMP-9蛋白表達(dá)顯著高于8周齡SHR和WKY大鼠及16周齡WKY大鼠,而TIMP-3蛋白表達(dá)在4組間改變并不顯著。同時(shí)16周齡SHR胸主動(dòng)脈Fibulin-3、 MMP-2、MMP-9的mRNA水平表達(dá)顯著高于8周齡SHR和WKY大鼠及16周齡WKY大鼠；因TIMP-3蛋白表達(dá)水平低,未進(jìn)行mRNA水平水平檢測。大鼠血管壁Fibulin-3蛋白表達(dá)水平與MMP-2、MMP-9表達(dá)水平之間進(jìn)行相關(guān)性分析顯示,Fibulin-3與MMP-2呈正相關(guān)(r=0.518, P=0.001);Fibulin-3與MMP-9呈正相關(guān)(r=0.674,P=0.000)。結(jié)論：16周齡的SHR出現(xiàn)高血壓血管重構(gòu),Fibulin-3、MMP-2和MMP-9在高齡SHR主動(dòng)脈壁中表達(dá)增加,Fibulin-3表達(dá)水平和MMP-2,9水平存在相關(guān)性,可能參與了高血壓血管重構(gòu)的病理過程。第二章Fibulin-3對(duì)高血壓大鼠血壓及主動(dòng)脈重構(gòu)的影響目的：探討Fibulin-3和MMP-2,9、TIMP-3在自發(fā)性高血壓大鼠中高血壓血管重構(gòu)的表達(dá)及高血壓血管重構(gòu)血管纖維組織(包括膠原纖維、彈力纖維和網(wǎng)狀纖維)的病理改變和胸主動(dòng)脈氧化應(yīng)激水平的變化；同時(shí)通過尾靜脈注射外源性Fibulin-3蛋白提高體內(nèi)Fibulin-3水平,研究Fibulin-3對(duì)高血壓大鼠血壓、胸主動(dòng)脈壁纖維組織和氧化應(yīng)激水平及MMP-2,9、TIMP-3的影響。方法：30只8周齡雄性SHR大鼠隨機(jī)分為3組：分別經(jīng)尾靜脈注射外源性Fibulin-3蛋白120mg/kg(低劑量組,FBLN1組,n=10)、240mg/kg(高劑量組,FBLN2組,,n=10)和生理鹽水(安慰劑組,n=10),每周注射1次至16周齡；同周齡雄性的Wistar大鼠10只作為對(duì)照組；所有大鼠均購買于北京維通利華公司,合格證書號(hào)：SCXK(滬2003-0003)。所有大鼠喂養(yǎng)至16周齡,經(jīng)腹腔注射3%戊巴比妥鈉(50mg/kg)麻醉處死,解剖,取出胸主動(dòng)脈作為研究對(duì)象。胸主動(dòng)脈經(jīng)蘇木素-伊紅(H-E)染色分析血管壁厚度和管壁/腔比值；Masson三色染色法檢測血管壁膠原纖維的表達(dá)；醛品紅法染色檢測血管壁彈力纖維的表達(dá)：氫氧化銀氨液浸染法檢測網(wǎng)狀纖維的表達(dá)；冰凍切片經(jīng)二氫乙啶(Dihydroethidium, DHE)孵育后,綠光激發(fā)顯示血管活性氧族物質(zhì)(Reactive Oxygen Species, ROS)在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。免疫組織化學(xué)染色和Western blot蛋白電泳分析胸主動(dòng)脈Fibulin-3、 MMP-2、MMP-9、TIMP-3蛋白水平表達(dá)；RT-PCR檢測胸主動(dòng)脈Fibulin-3、 MMP-2、MMP-9的mRNA水平表達(dá)；運(yùn)用Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)免疫組化染色切片進(jìn)行灰度定量。結(jié)果：在所有SHR中,大鼠血壓(安慰劑組224±15.0mmHg、FBLN1組207±14.5mmHg和FBLN2組180±13.7mmHg)顯著高于對(duì)照組血壓(121±10.0mmHg),差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；在FBLN1組和FBLN2組中,大鼠血壓有所下降,以FBLN2組血壓(180±13.7mmHg)下降顯著,與安慰劑組(224±15mmHg)比較,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；與對(duì)照組比較,安慰劑組可見到顯著血管重構(gòu)改變,胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞排列紊亂,出現(xiàn)管壁增厚(97.78±5.39um vs82.23±6.02um),血管壁/腔比值增大(7.91±0.6% vs 6.35±0.55%),差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；在FBLN1組和FBLN2組中可見胸主動(dòng)脈血管管壁明顯增厚(105.99±5.92um和121.7±10.81um),與安慰劑組比較,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),FBLN2組與FBLN1組比較,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；但FBLN1組與FBLN2組血管壁/管腔比值(8.15±0.38%和7.96±0.41%),增大不明顯,與安慰劑組(7.91±0.6%)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；在對(duì)照組胸主動(dòng)脈中,血管壁膠原纖維分布較為零散,中膜彈力纖維板排列整齊,中膜彈力纖維板完整、排列整齊、有序；而在安慰劑組中,可見到在胸主動(dòng)脈中,膠原纖維成分顯著增多,彈力纖維排列疏松、紊亂,甚至斷裂,數(shù)量減少,肌纖維肥大增生顯著；與安慰劑組比較,FBLN1組和FBLN2組膠原均有所減少,FBLN2組膠原數(shù)量與對(duì)照組相近,而彈力纖維數(shù)量較安慰劑組顯著增多,比較完整,排列整齊,纖維束橫徑顯著粗,FBLN2組的彈力纖維增粗最為顯著；采用image plus軟件對(duì)各組中彈力纖維橫徑進(jìn)行測量,結(jié)果顯示：安慰劑組(4.56±0.70um)、FBLN1組(5.03±0.86 um)和FBLN2組(7.61±0.89 um)均高于對(duì)照組(3.52±0.63 um)比較,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05); FBLN2組高于安慰劑組和FBLN1組,差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。在網(wǎng)狀纖維染色中,中膜網(wǎng)狀纖維呈黑色,附著于彈力纖維周圍；在高血壓大鼠中(安慰劑組、FBLN1組和FBLN2組)網(wǎng)狀纖維較對(duì)照組顯著增多,但三組間無顯著差異。在血管氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)中,ROS陽性細(xì)胞在整個(gè)核區(qū)被染成紅色,可以看到,正常大鼠主動(dòng)脈壁陽性細(xì)胞少或無,安慰劑組血管環(huán)中可見較多陽性細(xì)胞胞核染成紅色,說明血管氧化性高；FBLN1組和FBLN2組陽性細(xì)胞數(shù)較安慰劑組減少,以FBLN2組為顯著,說明Fibulin-3治療后顯著抑制血管氧化水平。進(jìn)一步通過免疫組化、western blot檢測胸主動(dòng)脈Fibulin-3、MMP-2、MMP-9、TIMP-3蛋白的表達(dá),顯示安慰劑組的SHR胸主動(dòng)脈Fibulin-3、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組；在注射Fibulin-3蛋白低劑量組(FBLN1組)和高劑量組(FBLN2組)中,Fibulin-3蛋白表達(dá)有所升高,以FBLN2組升高比較顯著；而MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)在FBLN1組和FBLN2組有所減弱,以FBLN2組減弱比較顯著。而TIMP-3蛋白表達(dá)在4組間改變并不顯著,因TIMP-3蛋白表達(dá)低下,未進(jìn)行mRNA水平檢測。同時(shí),通過RT-PCR檢測大鼠胸主動(dòng)脈Fibulin-3、MMP-2、MMP-9的mRNA表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)Fibulin-3、MMP-2、MMP-9的mRNA水平在安慰劑組高于對(duì)照組,在FBLN1組和FBLN2組中,Fibulin-3的mRNA水平有所升高,以FBLN2組升高比較顯著,MMP-2、MMP-9的mRNA水平在FBLN1組和FBLN2組有所下降,以FBLN2組下降比較顯著。結(jié)論：高血壓血管重構(gòu)時(shí)可出現(xiàn)血管壁增厚,血管壁／腔比值增加,膠原纖維成分明顯增多,彈力纖維排列疏松、紊亂,甚至斷裂,血管氧化水平增高；Fibulin-3及MMP-2、MMP-9參與高血壓血管重構(gòu)的發(fā)生過程；注射外源性Fibulin-3蛋白可以降低高血壓大鼠的血壓水平,改變胸主動(dòng)脈血管重構(gòu)的病理表現(xiàn),抑制膠原纖維增生,對(duì)彈力纖維損傷起到修復(fù)作用,同時(shí)抑制血管氧化應(yīng)激狀態(tài),抑制血管壁MMP-2、MMP-9表達(dá)水平。第三章Fibulin-3與MMP-9/TIMP-3在高血壓病人血清中的表達(dá)及其與脈搏波傳導(dǎo)速度的相關(guān)性目的：探討高血壓病人血清Fibulin-3、MMP-9與TIMP-3水平改變的臨床意義及其與肱-踝脈搏波傳導(dǎo)速度(branchial-ankle Pulse Wave Velocity, baPWV)的相關(guān)性在高血壓血管重構(gòu)的作用。方法：收集我院住院及門診就診高血壓患者50例以及體檢的健康人38例作為對(duì)照人群,所有入選者均于空腹抽取靜脈血4毫升,經(jīng)離心機(jī)3000轉(zhuǎn)／分離心處理后,抽取上清液,放-80℃冰箱貯存。所有血標(biāo)本成批以酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)方法檢測血清Fibulin-3、MMP-9、 TIMP-3表達(dá)；采用脈搏波速度自動(dòng)測定儀測定baPWV。結(jié)果：高血壓病人血清Fibulin-3水平較正常人顯著下降,差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(52.64±24.30 ng/ml vs 78.44±23.37 ng/ml,P0.001而兩組間血清MMP-9和TIMP-3水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(40.82±13.73 ng/ml vs 40.57±11.29 ng/ml,P0.05; 5.41±2.29ng/ml vs 6.32±2.67ng/ml, P0.05);高血壓病人肱-踝脈搏波傳導(dǎo)速度(baPWV)較正常人顯著升高,差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1725.28±366.86 cm/svs 1365.50±235.33 cm/s,P0.001)=通過Peaeson相關(guān)性分析表明,所有研究對(duì)象血清Fibulin-3水平與baPWV之間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.328,P=0.002)：而MMP-9和baPWV之間無相關(guān)性(r=-0.030, P=0.784); TIMP-3和baPWV之間無相關(guān)性(r=0.002,P=0.984)。結(jié)論：高血壓血管重構(gòu)存在細(xì)胞外基質(zhì)的變化和動(dòng)脈功能改變,檢測血清Fibulin-3水平和baPWV可作為高血壓早期反映動(dòng)脈功能改變的指標(biāo)之一,對(duì)判斷高血壓靶器官損害有一定幫助。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R544.1
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本文編號(hào)：1312532