本文關鍵詞：活體成像監(jiān)測納米金激活肝臟SAA及SAA促進T細胞遷移作用研究　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：背景:隨著納米科技的迅猛發(fā)展,納米尺度材料在生物醫(yī)藥領域的應用越來越廣泛,納米顆粒對環(huán)境以及人類健康的影響逐漸引起人們關注。納米材料的理化性質(zhì)是決定其在生物體內(nèi)命運的基礎,如形貌、粒徑、表面化學等,直接決定其與體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)和吞噬性細胞作用的方式和代謝途徑。肝臟是人體中重要的解毒器官,也是納米材料在人體內(nèi)的主要蓄積地點之一,因此,充分評估納米顆粒暴露后以肝臟炎性反應為首的不良反應是至關重要的。然而,目前無論是臨床還是實驗室均缺乏明確的、具有高靈敏度和高認可度的生物學指標用于評估和指示納米藥物、納米佐劑或納米造影劑暴露后,肝臟炎癥細胞、炎性介質(zhì)以及所發(fā)生的急性免疫反應之間的復雜相互作用。血清淀粉樣蛋白A(SAA)是一種非常靈敏的急性時相反應蛋白,肝臟是急性時相反應期間合成SAA的主要場所。已有研究嘗試將SAA、C反應蛋白(C-reactive protein,CRP)聯(lián)合觸珠蛋白(haptoglobin,HP)作為生物標志物進行二氧化硅納米材料暴露毒性的預測。那么,可否將SAA作為一種靈敏、可靠的生物學指標用來評估和篩選應用廣泛的系列納米金材料,并探究其引起的急性毒性與其粒徑形貌之間的關聯(lián)呢?SAA除了可能作為一種靈敏的納米肝毒性生物標志物之外,也具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。已有報道表明,急性炎癥期間,循環(huán)系統(tǒng)中升高的SAA作用于單核巨噬細胞,促進其分泌系列趨化因子,從而招募更多的白細胞到炎癥部位。那么SAA在體內(nèi)是否能夠調(diào)控T細胞的遷移和歸巢,增強CTL細胞的殺傷功能,并增強其抗腫瘤作用效果呢?為回答上述科學問題,我們開展本論文的研究工作。目的:針對SAA可能作為一種靈敏、可靠的納米肝毒性生物學標志物及其在機體炎癥免疫調(diào)節(jié)中的作用效果,本研究旨在探討SAA是否能夠作為評價納米金暴露引起肝臟急性炎癥反應的生物學指標,并闡明涉及其中的炎癥級聯(lián)反應和信號通路的相關機制;同時探索SAA對過繼性T細胞在體內(nèi)趨化及遷移歸巢的調(diào)控作用,并闡明其相關機制。方法及結果:(1)SAA-Luc小鼠模型和STAT3-Luc小鼠模型的建立及驗證。應用水動力高壓轉(zhuǎn)染技術結合密碼子優(yōu)化的噬菌體整合酶體系,將SAA和STAT3的報告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到小鼠肝臟,并且整合到小鼠染色體中,通過活體熒光成像系統(tǒng),實現(xiàn)對上述功能蛋白的實時、動態(tài)、無創(chuàng)監(jiān)測。結果發(fā)現(xiàn),在相同刺激水平的情況下,通過小鼠模型得到的結果與采用傳統(tǒng)蛋白檢測方法得到的結果基本吻合。同時,由于引入了噬菌體整合酶體系,能夠?qū)崿F(xiàn)報告基因在肝實質(zhì)細胞中的長時間穩(wěn)定表達,建模90天后的SAA-Luc小鼠模型依然能夠?qū)χ嗵?Lipopolysaccharide,LPS)產(chǎn)生強烈且迅速的響應。說明肝臟SAA及STAT3可視化小鼠模型構建成功,并且上述小鼠模型尤其適合于對肝臟功能蛋白進行長期的動態(tài)監(jiān)測。(2)納米金因形貌和粒徑的不同激活的肝臟SAA表達有明顯差異。采用可視化SAA-Luc小鼠模型評價了6種不同形貌和粒徑納米金的肝臟急性炎癥反應,其激活肝臟SAA表達的強弱順序為:GNS50GNS30GNS10GNCsGNRsGNS80,其中處于臨界尺度的粒徑約50nm的球形納米金相比其他尺寸及形貌材料能夠引起更強的肝臟急性炎癥反應。上述結果同時說明,在相同表面修飾情況下,肝區(qū)細胞攝取納米材料的途徑和引起肝臟炎癥反應的程度由納米粒子的幾何形狀、尺度及其在生物體內(nèi)的分布共同決定。在所考察的尺度范圍內(nèi),球型納米金引起肝臟急性炎癥的強弱具有尺度依賴性,但是該影響非線性相關。(3)SAA-Luc小鼠模型對納米金刺激的響應更靈敏。在0.02、0.1、0.5和2.5 mg/kg的GNS50暴露劑量下分別使用SAA-Luc小鼠模型和ELISA檢測SAA的表達量。結果表明,0.1mg/kg的GNS50暴露后應用小鼠模型能夠監(jiān)測到SAA的表達,其峰值熒光強度為基礎值的5倍左右,而此時ELISA已經(jīng)檢測不到血清中SAA濃度的變化。同時發(fā)現(xiàn)在2.5 mg/kg的GNS50暴露下應用SAA-Luc小鼠模型檢測到的SAA表達峰值時間早于通過ELISA得到的結果(4h vs.12h)。上述結果說明基于活體熒光成像技術的SAA-Luc小鼠模型相較于ELISA等血清學檢測方法不僅更靈敏,而且可以實現(xiàn)對納米暴露的早期預警。(4)納米金暴露后誘導肝臟Kupffer細胞M1極化,分泌系列促炎因子,啟動SAA表達。ELISA檢測了GNS50暴露后2h內(nèi)肝臟研磨液中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。結果表明,這些促炎因子在納米金暴露后1h即明顯升高。隨后使用SAA-Luc小鼠模型動態(tài)評價了GNS50暴露后1h到2h之間SAA的激活,發(fā)現(xiàn)從80min后開始能夠監(jiān)測到小鼠肝臟SAA的表達,晚于肝臟促炎因子升高的時間。分別注射IL-1β、IL-6或TNF-α到小鼠體內(nèi)均能明顯激活SAA表達。為探究這些細胞因子的來源,我們檢測了納米金暴露后肝臟Kupffer細胞和骨髓來源巨噬細胞表型的變化。結果表明,納米金能夠誘導肝臟Kupffer細胞M1極化,極化后的巨噬細胞能夠分泌大量IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子。將肝臟Kupffer細胞去除以檢測Kupffer是否是SAA激活早期肝臟中促炎因子的主要來源。結果表明,受Kupffer細胞去除的影響,肝臟促炎因子早期分泌受到明顯抑制,肝臟SAA的表達明顯滯后。上述結果表明納米金暴露后隨血液循環(huán)系統(tǒng)進入肝區(qū),首先與肝臟Kupffer細胞相互作用,誘導其發(fā)生M1極化,分泌系列促炎因子,啟動SAA表達。(5)納米金通過NF-κB信號通路激活肝臟SAA表達。通過NF-κB-Luc小鼠模型和STAT3-Luc小鼠模型,結合EMSA和Western Blot等方法,證明了GNS50能夠激活肝臟NF-κB和STAT3信號通路。使用NF-κB抑制劑PDTC能夠明顯抑制SAA的表達,但是在使用STAT3信號通路的抑制劑ASD1480和Cryptotanshinone后SAA的表達卻沒有受到明顯的抑制。這些結果說明納米金誘導的肝臟SAA表達經(jīng)由NF-κB信號通路。(6)SAA調(diào)控過繼性T細胞的遷移和歸巢。SAA瘤內(nèi)注射后,能夠明顯提高過繼性CD8+T細胞對腫瘤生長的抑制作用。進一步的機制研究結果表明,SAA能夠誘導腫瘤相關巨噬細胞發(fā)生M1再極化,分泌IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子以及CCL3、CCL5和CXCL9等趨化因子,逆轉(zhuǎn)腫瘤微環(huán)境的免疫抑制狀態(tài),促進過繼性CD8+T細胞向腫瘤部位趨化,從而增強其對腫瘤生長的抑制作用。結論:通過水動力高壓轉(zhuǎn)染結合密碼子優(yōu)化的噬菌體整合酶系統(tǒng)構建成了SAA-Luc和STAT3-Luc小鼠模型,能夠?qū)崟r、動態(tài)、并且長期對同一隊列小鼠SAA的表達分泌和STAT3信號通路的激活進行監(jiān)測。使用上述小鼠模型評價了納米金暴露引起的肝臟炎癥反應,闡明了其中的信號通路機制,為納米材料作為藥物載體、光熱治療試劑或疫苗佐劑等在生物醫(yī)藥領域中的應用評估提供了靈敏、可靠的動物模型體系。同時發(fā)現(xiàn)SAA能夠調(diào)控過繼性T細胞的遷移和歸巢,逆轉(zhuǎn)腫瘤微環(huán)境的免疫抑制狀態(tài),從而提高其抑制腫瘤生長的能力。
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R363

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