發(fā)布時(shí)間：2017-12-20 10:13

  本文關(guān)鍵詞：FBXW7與EBP1異構(gòu)體的差異性相互作用調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：大腸癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,是引起癌癥相關(guān)死亡的第五位主要因素。雖然手術(shù)切除并輔以化學(xué)治療和放射治療的多模式組合治療方法已經(jīng)應(yīng)用于不同階段大腸癌的治療,但目前大腸癌患者的死亡率仍然較高。盡管目前很多研究致力于大腸癌的早期診斷和靶向治療,但仍缺少較為有效的生物標(biāo)志物及預(yù)測(cè)指標(biāo)。因此,進(jìn)一步研究并明確有效的腫瘤標(biāo)志物及治療靶標(biāo)對(duì)于提高大腸癌患者的生存率至關(guān)重要。表皮生長(zhǎng)因子受體 ErbB3 結(jié)合蛋白(ErbB3 receptor binding protein 1,EBP1)是PA2G4蛋白家族成員,廣泛表達(dá)于人類(lèi)組織并參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞分化和細(xì)胞凋亡。研究表明EBP1有兩個(gè)亞型,分別為P48和P42。由于EBP1基因的選擇性剪切,P48亞型比P42亞型在N-端多54個(gè)氨基酸,這導(dǎo)致EBP1 P48和EBP1 P42有不同的生物學(xué)功能。EBP1 P48在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá),能促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞分化。研究報(bào)道在胰腺癌、宮頸癌和前列腺癌中EBP1 P48均表達(dá)增高,且高表達(dá)的EBP1 P48與腫瘤不良預(yù)后相關(guān),提示EBP1 P48能促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。與EBP1 P48的原癌基因作用相反,EBP1 P42通過(guò)抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞分化而發(fā)揮抑癌基因作用。雖然目前已經(jīng)明確EBP1 P48有癌基因活性而EBP1 P42主要發(fā)揮抑癌基因功能,但EBP1不同亞型在腫瘤中發(fā)揮不同生物學(xué)功能的調(diào)控機(jī)制尚不明確。FBXW7(F-box and WD repeat domain-containing7)屬于 F-box 蛋白家族,是 SCF(Skp1/Cul1/F-box)E3泛素連接酶復(fù)合體的靶蛋白識(shí)別組分。FBXW7包含兩個(gè)重要的功能結(jié)構(gòu)域:F-box結(jié)構(gòu)域和WD40結(jié)構(gòu)域;F-box結(jié)構(gòu)域可與Skp1結(jié)合形成SCFFBXW7復(fù)合體,WD40結(jié)構(gòu)域識(shí)別并結(jié)合特異性磷酸化底物(CPD),介導(dǎo)靶蛋白的泛素化降解。FBXW7在多種腫瘤中存在表達(dá)缺失或突變,其表達(dá)減低或功能缺失誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究報(bào)道FBXW7主要通過(guò)靶向泛素化降解癌蛋白發(fā)揮其抑癌作用,包括cyclin E,Notch,mTOR,Aurora-A和c-Myc等,從而參與調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、DNA損傷應(yīng)答和基因組穩(wěn)定性維持。作為腫瘤抑制基因,FBXW7的抑癌作用已被廣泛研究,然而目前對(duì)于FBXW7靶底物的鑒定及FBXW7表達(dá)缺失誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究并不充分。理解并研究FBXW7的生物學(xué)功能和新的作用網(wǎng)絡(luò)對(duì)于研究其抑癌作用和進(jìn)一步研發(fā)靶向藥物具有重要意義。本研究主要探討FBXW7與EBP1亞型的差異性相互作用及作用機(jī)制,明確FBXW7差異性調(diào)控EBP1亞型在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及意義。本研究的完成不僅進(jìn)一步明確了 FBXW7的腫瘤生物學(xué)功能,也為探索以FBXW7為靶標(biāo)的早期診斷指標(biāo)及治療靶點(diǎn)提供了理論依據(jù)。第一部分FBXW7差異性調(diào)控EBP1亞型表達(dá)及機(jī)制研究[目的]應(yīng)用雙向凝膠電泳(2-DE)和質(zhì)譜分析技術(shù)(MS)鑒定FBXW7新的靶底物,分析FBXW7對(duì)新鑒定靶底物的表達(dá)調(diào)控并明確調(diào)控機(jī)制,為進(jìn)一步研究FBXW7的生物學(xué)功能和新的調(diào)控通路奠定基礎(chǔ)。[方法]1.FBXW7新靶底物鑒定1.1應(yīng)用HCT116 FBW7+和FBBW7-/-細(xì)胞系,采用2-DE和MS分析FBXW7的新靶蛋白。1.2在人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468、人前列腺癌細(xì)胞DU145和PC3中,通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染 pSuper-puro-shFBXW7 A、pSuper-puro-shFBXW7 B 及其空 白 對(duì)照質(zhì)粒,構(gòu)建FBXW7穩(wěn)定低表達(dá)的細(xì)胞株及其對(duì)照組細(xì)胞。應(yīng)用qRT-PCR和Western blot分別檢測(cè)所構(gòu)建細(xì)胞系中FBXW7 mRNA及蛋白的表達(dá),同時(shí)檢測(cè)FBXW7新鑒定靶蛋白EBP1的表達(dá)。1.3 構(gòu)建 Myc-EBPl P48 和 Myc-EBP1 P42 表達(dá)質(zhì)粒,分別與 HA-FBXW7α 或HA-FBXW7α△F(F-box 缺失)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染 HEK293T 細(xì)胞,Western blot 檢測(cè)FBXW7對(duì)EBP1不同亞型的表達(dá)調(diào)控。2.FBXW7對(duì)EBP1 P48的降解及機(jī)制研究2.1 Myc-EBP1 P48 分別與 HA-Vector 或 HA-FBXW7α 共同轉(zhuǎn)染 HEK293T 細(xì)胞,應(yīng)用蛋白質(zhì)合成抑制劑放線(xiàn)菌酮(cycloheximide,CHX,50μg/ml)分別處理細(xì)胞Oh,1.5h,4h,6h,8h,Western blot 檢測(cè) FBXW7 對(duì)外源 EBP1P48 半衰期的影響。同樣方法處理HCT116F FBXW7+/+、HCT116FBXW7-/-和DLD-1 FBXW7+/+、DLD-1 FBXW7-/-細(xì)胞,Western blot進(jìn)一步檢測(cè)FBXW7對(duì)內(nèi)源EBP1 P48半衰期的影響。2.2 Myc-EBP1 P48 分別與 HA-Vector 或 HA-FBXW7α 共同轉(zhuǎn)染 HEK293T 細(xì)胞,分別應(yīng)用CHX或CHX與蛋白酶體抑制劑MG132(10μM)共同處理細(xì)胞6h,Western blot檢測(cè)MG132是否抑制FBXW7對(duì)EBP1 P48的降解。同樣方法處理HCT116FBXW7+/+、HCT116FBXW7-/-和DLD-1FBXW7++、DLD-11FBXW7-/-細(xì)胞,Western blot進(jìn)一步驗(yàn)證MG132對(duì)FBXW7降解EBP1 P48的影響。2.3 Flag-EBP1 P48、HA-Ubiquitin 和 Myc-FBXW7α 共同轉(zhuǎn)染 HEK293T 細(xì)胞,免疫沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FBXW7對(duì)EBP1 P48泛素化的影響。同時(shí)在HCT116 FBXW7+/+、HCT116 FBXW7-/-細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染HA-Ubiquitin,免疫沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不伺FBXW7表達(dá)量對(duì)EBP1 P48泛素化水平的影響。2.4 Flag-EBP1 P48轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EBP1 P48與GSK3β是否結(jié)合。2.5 Myc-EBP1 P48與HA-FBXW7α共同轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,其中一組細(xì)胞應(yīng)用GSK3β抑制劑Ⅶ進(jìn)行處理,Western blot檢測(cè)GSK3β抑制劑VⅦ對(duì)FBXW7降解EBP1 P48的影響。同樣方法處理HCT116 FBXW7+/+和HCT116 FBXW7-/-細(xì)胞,Western blot進(jìn)一步驗(yàn)證FBXW7對(duì)EBP1 P48的降解是否依賴(lài)于GSK3β對(duì)EBP1 P48的磷酸化。2.6 HA-Ubiquitin轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,同時(shí)應(yīng)用GSK3β抑制劑Ⅷ處理細(xì)胞,免疫沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GSK3β抑制劑Ⅷ是否影響EBP1 P48的泛素化水平。3.檢測(cè)FBXW7是否與EBP1 P48相互結(jié)合并確定結(jié)合位點(diǎn)3.1檢測(cè)FBXW7與EBP1 P48的相互結(jié)合HA-Vector 或 HA-FBXW7α 分別與 Flag-EBPl P48 共同轉(zhuǎn)染 HEK293T 細(xì)胞,免疫共沉淀檢測(cè)FBXW7與EBP1 P48的結(jié)合。同時(shí)應(yīng)用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HCT116細(xì)胞中內(nèi)源FBXW7與內(nèi)源EBP1 P48的結(jié)合。3.2檢測(cè)FBXW7與EBP1 P48結(jié)合的功能位點(diǎn)3.2.1 HA-FBXW7α,HA-FBXW7α△F、HA-FBXW7α△WD(WD40 結(jié)構(gòu)域表達(dá)缺失)和 HA-FBXW7αWD 結(jié)構(gòu)域點(diǎn)突變質(zhì)粒(R465C、R465H、R479H、R505C)分別與F1ag-EBPl P48共同轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FBXW7表達(dá)缺失或突變質(zhì)粒與EBP1 P48的結(jié)合,確定FBXW7與EBP1 P48結(jié)合的功能片段。3.2.2根據(jù)3.2.1中確定的FBXW7功能片段,將缺失該片段的FBXW7與Flag-EBPl P48和Myc-Ubiquitin共同轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,免疫沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)EBP1 P48泛素化的影響,同時(shí)應(yīng)用Western blot檢測(cè)FBXW7缺失該片段后對(duì)EBP1 P48蛋白表達(dá)的影響。3.3分析EBP1 P48與FBXW7相互作用的功能位點(diǎn)3.3.1應(yīng)用磷酸位點(diǎn)分析軟件分析EBP1 P48蛋白序列中可能的GSK3β磷酸化位點(diǎn),根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果構(gòu)建EBP1 P48表達(dá)缺失質(zhì)粒Myc-EBPl P48△40-44和Myc-EBPl P48△88-94。3.3.2 HA-FBXW7α 分別與 Myc-EBPl P48A40-44 或 Myc-EBPl P48A88-94 共同轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,免疫共沉淀檢測(cè)EBP1 P48△40-44或EBP1 P48A88-94與FBXW7的結(jié)合。3.3.3 HA-FBXW7α 分別與 Myc-EBPl P48△40-44 或 Myc-EBPl P48A88-94 共同轉(zhuǎn)染 HEK293T 細(xì)胞,Western blot 檢測(cè) FBXW7 對(duì) Myc-EBPl P48A40-44 或Myc-EBP1 P48A88-94蛋白表達(dá)的影響。同時(shí)應(yīng)用CHX處理細(xì)胞,Western blot進(jìn)一步檢測(cè) FBXW7 對(duì) Myc-EBP1 P48A40-44 或 Myc-EBP1 P48△88-94 半衰期的影響。3.3.4 Myc-EBP1P48△40-或 Myc-EBP1 P48A88-94 分別與HA-FBXW7 共同轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,應(yīng)用CHX或CHX與MG132共同處理細(xì)胞6h,Western blot檢測(cè)在 MG132 作用下 FBXW7α 對(duì) Myc-EBP1 P48△40-44 或 Myc-EBP1 P48A88-94蛋白表達(dá)的影響。3.3.5根據(jù)上述結(jié)果明確EBP1 P48功能片段,構(gòu)建針對(duì)該片段的EBP1 P48點(diǎn)突變質(zhì)粒Flag-EBP1 P48S40A,將該質(zhì)粒與FBXW7共同轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,Western blot檢測(cè)FBXW7對(duì)EBP1 P48S40A蛋白表達(dá)的影響。3.3.6 Flag-EBP1 P48S40A 與 HA-FBXW7α 共同轉(zhuǎn)染 HEK293T 細(xì)胞,免疫共沉淀檢測(cè)FBXW7與EBP1 P48S40A是否結(jié)合。3.3.7 HA-Vector 或 HA-FBXW7α 分別與 Flag-EBP1 P48S40A 和 Myc-Ubiquitin 共同轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,免疫沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FBXW7是否影響EBP1 P48S40A的泛素化水平。[結(jié)果]1.FBXW7差異性調(diào)控EBP1亞型的表達(dá)。1.1 2-DE和MS實(shí)驗(yàn)提示EBP1為FBXW7新的靶蛋白。1.2成功構(gòu)建MDA-MB-468、DU145和PC3穩(wěn)定低表達(dá)FBXW7細(xì)胞系,qRT-PCR和Western blot驗(yàn)證細(xì)胞系構(gòu)建成功;FBXW7低表達(dá)能明顯上調(diào)EBP1 P48的表達(dá)量,而對(duì)EBP1 P42的表達(dá)量無(wú)影響。1.3高表達(dá)FBXW7能顯著降低EBP1 P48的蛋白表達(dá),而對(duì)EBP1 P42的蛋白表達(dá)無(wú)影響。2.FBXW7以GSK3β依賴(lài)方式泛素化降解EBP1 P48。2.1在CHX作用下,高表達(dá)FBXW7能顯著縮短EBP1 P48半衰期,而HCT116細(xì)胞中FBXW7表達(dá)缺失顯著延長(zhǎng)EBP1 P48半衰期。2.2應(yīng)用蛋白酶體抑制劑MG132能阻斷FBXW7對(duì)EBP1 P48的降解。2.3 FBXW7能促進(jìn)EBP1 P48的泛素化水平。2.4 EBP1 P48 與 GSK3β 相互結(jié)合。2.5 FBXW7對(duì)EBP1 P48的降解依賴(lài)于GSK3β對(duì)EBP1 P48的磷酸化。2.6GSK3β抑制劑Ⅷ能抑制EBP1 P48的泛素化水平。3.FBXW7通過(guò)其WD40結(jié)構(gòu)域與EBP1 P48 S40相互結(jié)合。3.1 FBXW7 與 EBP1 P48 相互結(jié)合。3.2 FBXW7通過(guò)其WD40結(jié)構(gòu)域與EBP1 P48結(jié)合,缺失WD40結(jié)構(gòu)域影響FBXW7對(duì)EBP1 P48的泛素化降解。3.3 EBP1 P48通過(guò)其第40位絲氨酸位點(diǎn)與FBXW7相結(jié)合3.3.1 成功構(gòu)建 EBP1 P48 表達(dá)缺失質(zhì)粒 Myc-EBP1 P48△40-44 和 Myc-EBP1 P48△88-94。3.3.2 EBP1 P48缺失第40-44位氨基酸后不能與FBXW7結(jié)合,而缺失第88-94位氨基酸仍然可以與FBXW7結(jié)合。3.3.3 FBXW7能降低EBP1 P48A88-94的蛋白表達(dá)且明顯縮短其半衰期,而對(duì)EBP1 P48A40-44的蛋白表達(dá)和半衰期無(wú)影響。3.3.4 MG132 能阻斷 FBXW7 對(duì) EBP1 P48A88-94 的降解,而對(duì) EBP1 P48A40-44的表達(dá)無(wú)影響。3.3.5成功構(gòu)建Flag-EBP1 P48S40A(絲氨酸突變?yōu)楸彼?質(zhì)粒。Western blot結(jié)果表明FBXW7對(duì)EBP1 P48S40A的蛋白表達(dá)無(wú)影響。3.3.6 FBXW7 與 EBP1 P48S40A 不結(jié)合。3.3.7 FBXW7不能影響EBP1 P48S40A的泛素化水平。[結(jié)論]1.FBXW7差異性調(diào)控EBP1亞型的表達(dá)2.EBP1 P48是FBXW7的靶底物:FBXW7通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑降解EBP1 P48,且這一降解作用依賴(lài)于GSK3β對(duì)EBP1 P48的磷酸化作用。3.FBXW7與EBP1 P48相互結(jié)合:FBXW7通過(guò)WD40結(jié)構(gòu)域與EBP1 P48結(jié)合,而EBP1 P48通過(guò)第40位絲氨酸位點(diǎn)與FBXW7結(jié)合。第二部分EBP1 P48介導(dǎo)FBXW7對(duì)大腸癌細(xì)胞的作用及機(jī)制研究[目的]第一部分研究結(jié)果表明FBXW7靶向調(diào)控EBP1 P48蛋白表達(dá),本部分通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤模型檢測(cè)FBXW7對(duì)大腸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及轉(zhuǎn)移的抑制作用是否通過(guò)EBP1 P48介導(dǎo),并探討EBP1 P48介導(dǎo)FBXW7功能的分子機(jī)制。[方法]1.在HCT116FBXW7-/-細(xì)胞中特異性干擾EBP1 P48的表達(dá),通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的改變;通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾EBP1 P48的表達(dá)對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響;通過(guò)Matrigel實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾EBP1 P48的表達(dá)對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響。2.應(yīng)用HCT116FBBW7+/+、FBXXW7-/-和FBXW7-/-shEBP1 P48細(xì)胞系建立裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤模型,通過(guò)HE染色檢測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移情況,研究FBXW7表達(dá)缺失引起的腫瘤轉(zhuǎn)移是否通過(guò)EBP1 P48介導(dǎo)。3.應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)大腸癌腫瘤組織和癌旁正常組織中FBXW7和EBP1P48的表達(dá),并分析其表達(dá)相關(guān)性。4.HA-FBXW7α和F1ag-EBP1 P48共同轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,分別提取細(xì)胞質(zhì)蛋白和細(xì)胞核蛋白,Western blot檢測(cè)EBP1 P48是否影響FBXW7的細(xì)胞內(nèi)定位;同時(shí)應(yīng)用免疫熒光實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。5.HCT116FBXW7+/+、FBXW7-/-細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染EBP1 P48,應(yīng)用qRT-PCR和Western blot分別檢測(cè)EBP1 P48對(duì)FBXW7靶底物mRNA和蛋白表達(dá)的影響。6.HA-FBXW7α和Flag-EBP1 P48共同轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,免疫共沉淀檢測(cè)EBP1 P48是否抑制FBXW7與已知靶底物的結(jié)合。[結(jié)果]1.HCT116FBXW7-/-細(xì)胞中干擾EBP1 P48的表達(dá)能逆轉(zhuǎn)因FBXW7表達(dá)缺失引起的大腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的改變。2.裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤實(shí)驗(yàn)表明干擾EBP1 P48表達(dá)能抑制FBXW7表達(dá)缺失引起的大腸癌細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的改變。3.與正常組織相比,大腸癌組織中FBXW7表達(dá)明顯減低,而EBP1P48表達(dá)明顯增高,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析提示兩者表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。4.EBP1 P48促進(jìn)FBXW7由細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)移位。5.EBP1 P48抑制FBXW7對(duì)靶底物的降解。6.EBP1 P48抑制FBXW7與靶底物的結(jié)合。[結(jié)論]1.EBP1 P48介導(dǎo)FBXW7表達(dá)缺失引起的大腸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的改變。2.EBP1 P48能促進(jìn)FBXW7由細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)移位,從而抑制FBXW7與靶底物的結(jié)合,進(jìn)而抑制FBXW7對(duì)靶底物的降解。第三部分EBP1 P42促進(jìn)FBXW7對(duì)大腸癌細(xì)胞的抑癌作用及機(jī)制研究[目的]第一部分結(jié)果表明FBXW7對(duì)EBP1 P42蛋白表達(dá)沒(méi)有影響,但EBP1 P42作為EBP1的一個(gè)亞型是否與EBP1 P48 一樣參與FBXW7功能調(diào)控還未知。該部分?jǐn)M通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)研究EBP1 P42與FBXW7是否有相互作用,明確EBP1 P42與FBXW7的相互作用對(duì)大腸癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。[方法]1.HA-Vector 或 HA-FBXW7α 分別與 Flag-EBP1 P42 共同轉(zhuǎn)染 HEK293T 細(xì)胞,免疫共沉淀檢測(cè)FBXW7與EBP1 P42是否結(jié)合。2.HA-FBXW7α,HA-FBXW7α△F、HA-FBXW7α△WD、HA-FBXW7αN△F(F-box和WD40結(jié)構(gòu)域均缺失)和HA-FBXW7αWD結(jié)構(gòu)域點(diǎn)突變質(zhì)粒(R465C、R465H、R479H、R505C)分別與Flag-EBP1 P42共同轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FBXW7表達(dá)缺失或突變質(zhì)粒與EBP1 P42的結(jié)合,確定FBXW7與EBP1 P42結(jié)合的功能片段。3.根據(jù)上述結(jié)果構(gòu)建HA-FBXW7α△FR465C(F-box結(jié)構(gòu)缺失且WD40結(jié)構(gòu)域第465位氨基酸突變)質(zhì)粒,將該質(zhì)粒與Flag-EBP1 P42共同轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,免疫共沉淀檢測(cè)兩者是否相互結(jié)合。4.HA-FBXW7α、Myc-FBXW7α 和 Flag-EBP1 P42 共同轉(zhuǎn)染 HEK293T 細(xì)胞,免疫共沉淀檢測(cè)EBP1 P42是否影響FBXW7的二聚化,同時(shí)檢測(cè)EBP1 P42是否影響FBXW7與已知靶底物的結(jié)合。5.HCT116 FBXW7+/+、FBXW7-/-細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染EBP1 P42,應(yīng)用qRT-PCR和Western blot分別檢測(cè)EBP1 P42對(duì)FBXW7靶底物mRNA和蛋白表達(dá)的影響。6.HA-FBXW7α 分別與 Flag-Vector 或 Flag-EBP1 P42 共同轉(zhuǎn)染 HCT116FBXW7-/-細(xì)胞,通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EBP1 P42是否能增強(qiáng)FBXW7的腫瘤抑制作用。[結(jié)果]1.FBXW7與EBP1 P42相互結(jié)合。2.FBXW7可通過(guò)F-box結(jié)構(gòu)域直接與EBP1 P42結(jié)合。3.FBXW7靶底物介導(dǎo)EBP1 P42與FBXW7 WD40結(jié)構(gòu)域的結(jié)合。4.EBP1 P42促進(jìn)FBXW7二聚化并增強(qiáng)FBXW7與靶底物的結(jié)合。5.EBP1 P42促進(jìn)FBXW7對(duì)靶底物的降解。6.EBP1 P42能增強(qiáng)FBXW7的腫瘤抑制作用。[結(jié)論]1.FBXW7可通過(guò)F-box結(jié)構(gòu)域直接與EBP1 P42結(jié)合,此外FBXW7靶底物可介導(dǎo)EBP1 P42與FBXW7 WD40結(jié)構(gòu)域的結(jié)合。2.EBP1 P42能促進(jìn)FBXW7二聚化,并促進(jìn)FBXW7對(duì)靶底物的降解。3.EBP1 P42能增強(qiáng)FBXW7的抑癌作用。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R735.34

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 Yi Luan;Ping Wang;;FBW7-mediated ubiquitination and degradation of KLF5[J];World Journal of Biological Chemistry;2014年02期

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本文編號(hào)：1311707