本文關(guān)鍵詞：食管癌干細(xì)胞DNA甲基化譜及相關(guān)基因DNMT1功能的研究　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 食管癌 腫瘤干細(xì)胞 甲基化譜 RRBS 食管鱗狀細(xì)胞癌 腫瘤干細(xì)胞 DNMT1 5-aza-dC

【摘要】：我國是食管癌的高發(fā)區(qū),食管癌在我國的發(fā)生率位于惡性腫瘤的第三位,致死率位于第四位。鱗狀細(xì)胞癌是我國食管癌常見的病理類型。雖然目前腫瘤的治療有了長足進(jìn)展,但食管鱗癌的預(yù)后仍然較差,極易出現(xiàn)侵襲、復(fù)發(fā)、及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為腫瘤治療失敗根源是因為腫瘤中腫瘤干細(xì)胞的存在。腫瘤干細(xì)胞具有自我更新和多向分化的能力,治療后殘留的少量的腫瘤干細(xì)胞就可以引起腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移。所以研究腫瘤干細(xì)胞的干性維持機(jī)制,探索針對腫瘤干細(xì)胞的治療方法,才有可能提高腫瘤治療效果,防止腫瘤的復(fù)發(fā),達(dá)到腫瘤的根治。近來研究表明腫瘤干細(xì)胞和非干細(xì)胞的區(qū)別可能不是在于基因組,應(yīng)該更多的是表觀遺傳調(diào)控的不同。DNA甲基化作為表觀遺傳的重要調(diào)節(jié)方式,在腫瘤干細(xì)胞的調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。研究表明腫瘤干細(xì)胞與非干細(xì)胞具有不同的甲基化譜。而目前為止食管癌干細(xì)胞與非干細(xì)胞的甲基化譜尚沒有研究。本研究從食管癌細(xì)胞系KYSE150和EC109分選出富集食管癌干細(xì)胞的SP細(xì)胞,在本實驗室原代培養(yǎng)的食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Sl中分選出富集食管癌干細(xì)胞的腫瘤球細(xì)胞,利用減容代表亞硫酸氫鹽測序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)方法,對食管癌干細(xì)胞及非干細(xì)胞進(jìn)行了甲基化測序。RRBS方法是利用限制性內(nèi)切酶MspI對基因組進(jìn)行酶切,從而將CpG位點(diǎn)富集出來,重亞硫酸鹽(Bisulfite)處理,并進(jìn)行高通量測序繪制單堿基分辨率的DNA甲基化圖譜,是一種準(zhǔn)確、高效、經(jīng)濟(jì)的DNA甲基化研究方法。本研究以食管癌干細(xì)胞和非干細(xì)胞的RRBS測序數(shù)據(jù)為主要分析材料,首先對測序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾處理得到的高質(zhì)量clean reads。通過Promoter及CpG島的覆蓋度和測序深度統(tǒng)計、全基因組C堿基甲基化水平統(tǒng)計、Promoter/CpG島的甲基化分析、DNA甲基化信號在基因組的分布及DNA甲基化信號的基因組元件注釋,繪制食管癌干細(xì)胞與非干細(xì)胞的甲基化圖譜。采用的軟件swDMR及T-test檢驗方法,找出干細(xì)胞與非干細(xì)胞的差異性甲基化區(qū)域(Differentially Methylated Region,DMR)。對差異甲基化相關(guān)的基因進(jìn)行KEGG分析,對差異甲基化基因進(jìn)行生物通路富集分析。并進(jìn)行了差異甲基化基因功能富集(GO)分析。通過本研究我們繪制了食管癌干細(xì)胞與非干細(xì)胞的甲基化圖譜,找出了 40個在腫瘤干細(xì)胞與非干細(xì)胞差異甲基化區(qū)域,篩選出了 13個差異甲基化基因,為DNA甲基化對食管癌干細(xì)胞的調(diào)控研究提供了理論基礎(chǔ)。研究表明DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)作為DNA甲基化發(fā)生的重要酶,除了維持DNA的甲基化狀態(tài),在維持正常干細(xì)胞及多種腫瘤干細(xì)胞的自我更新及分化等干性方面有著重要作用。然而其在食管癌干細(xì)胞中的作用尚沒有研究。食管癌干細(xì)胞缺乏特異的標(biāo)志分子,分選較為困難。我們實驗室在前期研究已證明食管癌側(cè)群(Side population,SP)細(xì)胞具有食管癌干細(xì)胞的特性,而懸浮培養(yǎng)的食管癌腫瘤球細(xì)胞也更高的表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物如SOX2、OCT-4、BMI-1等,為食管癌干細(xì)胞的研究提供了良好的模型。故本研究采用了側(cè)群細(xì)胞分選和懸浮腫瘤球培養(yǎng)的方法,從食管鱗癌細(xì)胞系分選出富集食管癌干細(xì)胞的SP細(xì)胞和腫瘤球細(xì)胞。我們首先檢測了食管癌SP細(xì)胞和懸浮腫瘤球細(xì)胞中DNMT1的表達(dá)情況,并且用si-RNA干擾和DNMT1抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-aza-dC)兩種方法降低了食管癌細(xì)胞系KYSE150和EC109中DNMT1的表達(dá),使用SP細(xì)胞流式檢測、懸浮腫瘤球培養(yǎng)、裸鼠體內(nèi)成瘤實驗,檢測了食管癌干細(xì)胞數(shù)量、自我更新能力及體內(nèi)致瘤能力等干性的變化。通過細(xì)胞增殖實驗、克隆形成實驗、遷徙實驗、藥物敏感實驗觀察DNMT1敲除后腫瘤細(xì)胞增殖、克隆形成、遷徙及耐藥等惡性表型的變化,并且檢測了干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子SOX2及干細(xì)胞相關(guān)抑制性miRNAs包括miR-203,miR-141,miR-200A和miR-200B的變化,對DNMT1調(diào)控食管癌干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)進(jìn)行了初步探索。實驗結(jié)果顯示DNMT1在富集食管癌干細(xì)胞的SP細(xì)胞和腫瘤球細(xì)胞中是高表達(dá)的,伴隨著SP細(xì)胞向非SP細(xì)胞的分化,其表達(dá)降低。采用si-RNA干擾和5-aza-dC兩種方法敲降DNMT1的表達(dá)后,KYSE150和EC109細(xì)胞中SP細(xì)胞的比例降低,懸浮培養(yǎng)形成腫瘤球的數(shù)量及體積均減少,裸鼠體內(nèi)形成的移植瘤體積及重量也小于對照組,這說明敲降DNMT1后,食管癌干細(xì)胞的數(shù)量及自我更新能力降低。細(xì)胞增殖實驗、克隆形成實驗、遷徙實驗、藥物敏感實驗的結(jié)果表明,DNMT1敲除導(dǎo)致食管癌干細(xì)胞受抑后,細(xì)胞增殖、克隆形成、遷徙及耐藥能力均受到抑制。干細(xì)胞標(biāo)記物SOX2的表達(dá)在DNMT1敲降后也是下降的,腫瘤干細(xì)胞相關(guān)抑制性 miRNAs 如 miR-203,miR-141,miR-200A 和 miR-200B 在 5-aza-dC 組表達(dá)是升高的,而在Lenti-sh-DNMT1組沒有明顯變化。本研究結(jié)果表明DNMT1對于維持食管干細(xì)胞的數(shù)量及自我更新等干性有著重要作用,從而進(jìn)一步調(diào)控著食管癌細(xì)胞的惡性表型。DNMT1有可能成為針對食管癌干細(xì)胞治療的新靶點(diǎn)。本研究為針對腫瘤干細(xì)胞的食管癌治療提供了理論基礎(chǔ),有助于新的治療藥物或治療方法的研發(fā)。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.1

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 胡潔;王全凱;董琳;孫金秀;謝廣云;王健;許建寧;;甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯致人支氣管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中DNMT1及MBD1基因表達(dá)的變化[J];癌變·畸變·突變;2010年05期

2 顧立萍;劉斌;邢傳平;高自芳;蘇勤軍;錢震;董亮;;胃癌組織中Dnmt1的表達(dá)及其臨床病理意義[J];西北國防醫(yī)學(xué)雜志;2008年05期

3 劉斌;顧立萍;邢傳平;蘇勤軍;高自芳;錢震;董亮;;胃癌組織中Dnmt1基因mRNA和蛋白的表達(dá)[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2009年20期

4 王文軍;溫江濤;;DNMT1在食管癌中表達(dá)及臨床意義[J];中國實驗診斷學(xué);2011年07期

5 王紅;謝奇鵬;;砒霜對MRL/lpr自發(fā)性狼瘡小鼠外周血單個核細(xì)胞DNMT1及CD11a表達(dá)的影響[J];中華中醫(yī)藥學(xué)刊;2011年12期

6 趙先蘭;孟志英;喬玉環(huán);張會利;饒燕玲;;DAPK和DNMT1在宮頸癌中的相關(guān)性研究[J];免疫學(xué)雜志;2009年01期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 滕穎;食管癌干細(xì)胞DNA甲基化譜及相關(guān)基因DNMT1功能的研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2017年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前9條

1 戴恬美;溫度誘導(dǎo)煙粉虱DNA甲基化的特征和Dnmt1基因溫度耐受性功能的鑒定[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

2 吳夢華;敲低Dnmt1和Dnmt3b對小鼠胚胎成纖維細(xì)胞凋亡、周期和基因組DNA甲基化水平的影響[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

3 寧向紅;DNMT1和EZH2介導(dǎo)microRNA-200b/a/429基因甲基化沉默促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展[D];天津醫(yī)科大學(xué);2015年

4 武興;DNMT1基因多態(tài)性與胃癌患者預(yù)后的研究[D];吉林大學(xué);2016年

5 白劍;抑癌基因甲基化在食管鱗癌細(xì)胞株中的表達(dá)差異及其與DNMT1的關(guān)系[D];桂林醫(yī)學(xué)院;2016年

6 李旭峰;葉酸在MNNG致哈族DNMT1高表達(dá)細(xì)胞DNA損傷及相關(guān)信號通路中作用的研究[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2017年

7 楊娥;瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞DNMT1的表達(dá)及5-氮雜-2-脫氧胞苷對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的影響[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2013年

8 陶欣;DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）在胰腺癌中表達(dá)及意義[D];中國醫(yī)科大學(xué);2010年

9 王福飛;上調(diào)miR-148a表達(dá)對胰腺癌AsPC-1細(xì)胞DNMT1基因表達(dá)及細(xì)胞增殖和凋亡的影響[D];南昌大學(xué);2012年

，

本文編號：1311783