本文關(guān)鍵詞：1 原發(fā)性肝癌浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞空間異質(zhì)性分析 2 原發(fā)性肝癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)與預(yù)后關(guān)系研究　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2017年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：該博士論文由相對(duì)獨(dú)立的兩部分工作組成第一部分 原發(fā)性肝癌浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞空間異質(zhì)性分析背景:原發(fā)性肝癌(primary liver cancer,PLC),簡(jiǎn)稱(chēng)肝癌,是指在肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞發(fā)生的惡性腫瘤,是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。流行病學(xué)研究顯示,肝癌在全球癌癥殺手中位列第2位,在中國(guó),肝癌發(fā)病率居第4位,而死亡率卻僅次于肺癌及胃癌居第3位。盡管近幾年肝癌早期篩查、診斷和治療技術(shù)不斷提升,但是原發(fā)性肝癌的治療效果仍不盡人意。應(yīng)用腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(tumour infiltrating lymphocytes,TILs)的免疫療法在一些實(shí)體瘤病人中取得持久的療效,最近的研究也表明PD-1抗體Nivolumab治療晚期肝細(xì)胞癌患者具有可控的安全性和持久的客觀緩解,提示我們免疫治療應(yīng)用于原發(fā)性肝癌臨床治療的可能性。由于對(duì)肝癌腫瘤微環(huán)境中TILs的空間分布、腫瘤局部特征基因和腫瘤突變負(fù)荷等基本生物學(xué)特征以及他們之間的相互聯(lián)系所知甚少,因此有必要對(duì)TILs及其與腫瘤之間的相互作用進(jìn)行深入解析。目的:通過(guò)對(duì)原發(fā)性肝癌患者腫瘤內(nèi)不同區(qū)域和相應(yīng)的癌旁組織及外周血進(jìn)行TCRβ-鏈互補(bǔ)決定區(qū) 3(complementarity-determining region,CDR3)組庫(kù)測(cè)序、mRNA表達(dá)譜芯片和全外顯子組測(cè)序,揭示肝癌內(nèi)TILs的空間分布,探索腫瘤內(nèi)T細(xì)胞群多樣性與局部分子表型或突變負(fù)荷間的關(guān)系。為肝癌的免疫治療提供理論依據(jù)。材料和方法:我們的研究納入5例病理診斷為肝癌的患者,通過(guò)手術(shù)收集腫瘤組織、癌旁組織及外周血樣本,每例腫瘤組織按標(biāo)準(zhǔn)選取5個(gè)區(qū)域。組織石蠟切片判斷腫瘤細(xì)胞所占的比例。通過(guò)多重PCR捕獲和Illumina HiSeq 2500測(cè)序平臺(tái)對(duì)TCRβCDR3區(qū)進(jìn)行深度測(cè)序,同時(shí)采用mRNA表達(dá)譜芯片及IlluminaHiSeq 2000測(cè)序平臺(tái)對(duì)相應(yīng)組織的mRNA及外顯子捕獲試劑盒捕獲后的DNA區(qū)段進(jìn)行表達(dá)譜芯片分析和外顯子組測(cè)序。同時(shí)我們將Patient 4腫瘤組織5個(gè)區(qū)域RNA提取物進(jìn)行建庫(kù)和TCR組庫(kù)復(fù)測(cè),評(píng)估抽樣及測(cè)序技術(shù)引入的誤差。結(jié)果:5例原發(fā)性肝癌患者的25個(gè)腫瘤組織樣本測(cè)序所獲得的unique TCRβ reads為 2.55×105～9.88×105個(gè),癌旁組織為 3.33×105～7.51×105,外周血為 4.74×105～1.27×106,提示外周血中擁有比腫瘤組織和癌旁組織更多的T細(xì)胞類(lèi)型(外周血vs腫瘤,p0.001;外周血vs癌旁,p = 0.007)。腫瘤組織中頻率最高的前250個(gè)TCRβ序列(TOP250 ubiquitous序列)的累計(jì)頻率顯著高于外周血(p =0.039),此外,每個(gè)患者腫瘤組織與腫瘤組織TCR組庫(kù)之間的overlap顯著高于腫瘤組織與正常組織或腫瘤組織與外周血TCR組庫(kù)之間的overlap(腫瘤-腫瘤vs腫瘤-癌旁,p0.001;腫瘤-腫瘤vs腫瘤-外周血,p0.001)。每個(gè)腫瘤組織中都能檢測(cè)到的TOP250序列在5例患者中所占比例從7.92%-24.07%(中位數(shù)10.93%),而75.93-92.08%(中位數(shù)89.07%)的T細(xì)胞克隆為多樣性克隆。相關(guān)分析表明TILs克隆多樣性與腫瘤局部T細(xì)胞免疫評(píng)分(T cell infiltration score,TIS)及總免疫細(xì)胞評(píng)分(overall immune infiltration score,IIS)正相關(guān)(RshannonD1vsTlS=0.852,p0.001;RshannonD1vsTlS=0.798,p0.001),同時(shí)發(fā)現(xiàn)TILs克隆多樣性和TIS評(píng)分較高的腫瘤區(qū)域其PD-1表達(dá)和抗原提呈裝置(antigen presenting machinery,APM)也相對(duì)其他區(qū)域高(RshannonDIvs PD-1=0.613,p=0.001;RTIs vs PD-1=0.641,p=0.001;RshannonDI vs APM=0.574,p=0.003;RTISvsPD-1=0.56,p=0.004)。值得注意的是,T細(xì)胞群多樣性與腫瘤組織的非同義體細(xì)胞突變的數(shù)目無(wú)顯著相關(guān)(R=-0.288,p=0.163),腫瘤細(xì)胞突變負(fù)荷與APM也無(wú)顯著相關(guān)(R=-0.317,p=0.123)。結(jié)論:(1)肝癌患者腫瘤組織微環(huán)境內(nèi)存在腫瘤相關(guān)的T細(xì)胞。(2)腫瘤組織中TILs的分布具有空間異質(zhì)性。(3)腫瘤組織內(nèi)TILs多樣性和PD-1表達(dá)都存在空間異質(zhì)性,提示腫瘤微環(huán)境在免疫治療方案制定中非常關(guān)鍵。(4)提高腫瘤組織的APM是提高免疫治療應(yīng)答的關(guān)鍵。第二部分原發(fā)性肝癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)與預(yù)后關(guān)系研究背景:原發(fā)性肝癌是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。目前,肝癌的臨床治療手段主要有手術(shù)切除、肝移植、介入治療、射頻消融、放化療、分子靶向及免疫治療,首選治療方式為手術(shù)切除和肝移植。研究發(fā)現(xiàn),無(wú)論采用何種治療方法,改善患者術(shù)后生存的主要瓶頸均為術(shù)后不可避免的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。因此,肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移也成為了制約手術(shù)療效的主要因素。目前臨床上主要通過(guò)影像學(xué)檢查、血清標(biāo)志物等手段來(lái)對(duì)肝癌進(jìn)行診斷、治療和監(jiān)測(cè),但效果均不理想。自從循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells,CTCs)概念被提出,CTCs逐步進(jìn)入更多研究者的視野。由于CTCs是原發(fā)灶腫瘤的一部分,具有與原發(fā)灶腫瘤相似甚至相同的特性,因而部分學(xué)者認(rèn)為,CTCs可以作為一種代表原發(fā)灶腫瘤的“液態(tài)活檢標(biāo)本”或“標(biāo)記物”。隨著對(duì)CTCs在不同腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移進(jìn)程中的作用進(jìn)行系統(tǒng)而深入的研究,人們發(fā)現(xiàn)若能采取有效的方式對(duì)腫瘤患者進(jìn)行外周血CTCs檢測(cè),不僅有助于腫瘤的早期診斷及治療監(jiān)測(cè),還可以有效的對(duì)預(yù)后進(jìn)行預(yù)測(cè)。目的:分析肝癌患者病程中CTCs數(shù)量的變化及其與患者AFP水平、TNM分期及早期復(fù)發(fā)(6個(gè)月內(nèi))等臨床病理的關(guān)系,以進(jìn)一步探討CTCs檢測(cè)在原發(fā)性肝癌臨床診治中的應(yīng)用價(jià)值。方法:我們首先使用成像流式技術(shù)評(píng)估本實(shí)驗(yàn)室前期建立的oHSVI-hTERT-GFP檢測(cè)方法是否能特異性捕獲外周血中的肝癌細(xì)胞,隨后選取2015年9月至2016年10月間在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院腹部外科收集的60例原發(fā)性肝癌患者為研究對(duì)象。所有受檢者分別在手術(shù)前、術(shù)后第7天及術(shù)后3個(gè)月采集外周血4ml;使用oHSVI-hTERT-GFP法檢測(cè)患者外周血中的CTCs,分別分析術(shù)前、術(shù)后7天及術(shù)后3個(gè)月CTCs數(shù)量與患者AFP水平、肝硬化、乙肝表面抗原、腫瘤數(shù)目、腫瘤大小、TMN分期、分化程度、有無(wú)血管癌栓及有無(wú)復(fù)發(fā)(6個(gè)月內(nèi))等臨床病理的關(guān)系;并對(duì)病程中不同臨床病理特征患者的CTCs數(shù)量變化進(jìn)行分析,以進(jìn)一步探討CTCs檢測(cè)在原發(fā)性肝癌臨床診治中的應(yīng)用價(jià)值。結(jié)果:成像流式細(xì)胞儀成功檢測(cè)到肝癌患者術(shù)前外周血中CD45-/GFP+/GPC3+細(xì)胞。納入的60例原發(fā)性肝癌患者全部參與術(shù)前CTCs檢測(cè),分別有42例和35例患者參與術(shù)后7天和術(shù)后3個(gè)月的CTCs檢測(cè),其中有34例患者同時(shí)接受了 3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)CTCs的檢測(cè)。術(shù)前、術(shù)后7天和術(shù)后3個(gè)月CTCs檢測(cè)陽(yáng)性率分別為100%、100%和91.43%(32/35)。60例肝癌患者手術(shù)前外周血中CTCs數(shù)量與腫瘤數(shù)目及微血管栓塞顯著相關(guān),而手術(shù)后7天和手術(shù)后3個(gè)月外周血中的CTCs數(shù)量與各臨床病理參數(shù)之間無(wú)顯著相關(guān)。手術(shù)后第7天CTCs數(shù)量顯著高于手術(shù)前,而手術(shù)后3個(gè)月CTCs數(shù)量則顯著低于手術(shù)后第7天的CTCs數(shù)量,但是與手術(shù)前無(wú)顯著差異。不同的TNM分期,CTCs數(shù)量隨時(shí)間的變化模式也不盡相同,隨著病程的推移Ⅲ+Ⅳ期患者外周血CTCs數(shù)量呈逐漸升高的趨勢(shì)。結(jié)論:(1)手術(shù)前外周血中CTCs數(shù)量與原發(fā)性肝癌患者腫瘤數(shù)目及微血管栓塞顯著相關(guān)。(2)在肝癌病程發(fā)展中,Ⅲ+Ⅳ期患者外周血CTCs數(shù)量呈逐漸升高的趨勢(shì)。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R735.7
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本文編號(hào)：1309222