發(fā)布時間：2017-12-19 19:17

  本文關鍵詞：三種人獸共患病病原菌同步快速檢測技術研究　出處：《吉林大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：近年來,隨著經(jīng)濟水平的飛速發(fā)展和人們生活方式的轉變,許多新發(fā)傳染病越來越多呈現(xiàn)出“人獸共患”的模式。人獸共患病流行速度快,傳播途徑多,傳播范圍廣,不僅會給農(nóng)牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失,也會對人群健康帶來嚴重威脅。許多人獸共患病并不是由單一病原體引起,而是由兩種甚至多種病原體引起,缺乏特異性的臨床表現(xiàn),給臨床診斷和治療帶來了很大的難度。所以,加強對人獸共患病的監(jiān)控對于降低人獸共患病帶來的危害十分重要。目前對人獸共患病病原菌的檢測方法主要有傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法、免疫學方法和分子生物學方法,這些方法在使用時均存在一定程度的不足,如檢測時間長、步驟繁瑣、對實驗室和操作人員要求較高,或不能實現(xiàn)多種病原菌的同步檢測等。因此,尋求操作簡單、快速、準確的多種病原菌同步檢測的新方法,對于預防和控制人獸共患病、減少其帶來的經(jīng)濟損失和醫(yī)療負擔具有非常重要的意義。本研究選擇常見且高發(fā)的三種人獸共患病病原菌大腸桿菌O157:H7、單增李斯特菌和布魯氏菌作為目標病原菌,利用卵黃抗體技術制備能夠同時識別這三種病原菌的三價卵黃抗體,將其與羧基磁珠偶聯(lián)制備免疫磁珠,利用磁分離技術實現(xiàn)對待測樣品中三種病原菌的快速富集與分離;同時利用多克隆抗體制備技術制備大腸桿菌O157:H7和單增李斯特菌的兔多克隆抗體,以及實驗室前期制備的布魯氏菌兔多克隆抗體,將三種兔多克隆抗體分別與三種具有不同熒光發(fā)射波長的Cd Se/Zn S量子點偶聯(lián),制備三種量子點熒光生物探針,分別用于標記三種目的病原菌,最終建立一種基于免疫磁分離技術和量子點熒光標記技術的三種病原菌同步、快速、準確檢測的新方法。本課題的主要研究內容包括以下四個部分:第一部分三價卵黃抗體的制備及鑒定(1)按照菌懸液濃度1:1:1的比例制備大腸桿菌O157:H7、單增李斯特菌和布魯氏菌的三價滅活疫苗,免疫健康高產(chǎn)蛋雞,收集雞蛋,采用PEG 6000沉淀法提取三價卵黃抗體。(2)優(yōu)化間接ELISA法反應條件,采用間接ELISA法對免疫后蛋雞血清及所提取的三價卵黃抗體的效價進行測定。結果表明,隨著免疫時間的延長,血清及三價卵黃抗體的效價呈明顯的升高趨勢,在初次免疫后第6周時血清中已產(chǎn)生了較高抗體效價的三價抗血清,在初次免疫后第10周三價卵黃抗體對大腸桿菌O157:H7和布魯氏菌的抗體效價達到最高,第12周時對單增李斯特菌的抗體效價達到了最高。(3)采用BCA蛋白定量試劑盒測定三價卵黃抗體的蛋白含量。結果表明,所提取的三價卵黃抗體的蛋白含量范圍為5.73~21.03 mg·m L-1,其中第10周所提取的三價Ig Y的蛋白含量最高,為21.03 mg·m L-1。(4)采用間接ELISA法對三價卵黃抗體的特異性進行鑒定。結果表明,所制備的三價卵黃抗體僅與副溶血弧菌出現(xiàn)了交叉反應,與其他九種菌株均沒有出現(xiàn)交叉反應,特異性較好;采用SDS-PAGE電泳檢測卵黃抗體的純度,可以觀察到明顯的重鏈條帶和輕鏈條帶,純度較高。第二部分兔多克隆抗體的制備及鑒定(1)分別制備大腸桿菌O157:H7和單增李斯特菌的滅活疫苗,免疫健康新西蘭大白兔,收集抗血清,采用飽和硫酸銨沉淀法提取兔多克隆抗體。優(yōu)化抗體檢測的間接ELISA方法,并對抗體效價進行測定。結果表明,隨著免疫時間的延長,血清抗體效價逐漸升高,大腸桿菌O157:H7兔多克隆抗體血清效價在第四次加強免疫后10天達到1:256000,單增李斯特菌兔多克隆抗體血清效價在第四次加強免疫時達到1:256000。在第四次加強免疫后10天,采血收集抗血清,采用飽和硫酸銨沉淀法提取兩種兔多克隆抗體,所提取的大腸桿菌O157:H7兔多克隆抗體效價達到1:128000,單增李斯特菌兔多克隆抗體效價達到1:512000。(2)采用間接ELISA法對兩種兔多克隆抗體的特異性進行鑒定,結果表明所制備的大腸桿菌O157:H7多克隆抗體與金黃色葡萄球菌、鮑氏志賀氏菌和粘質沙雷氏菌出現(xiàn)了交叉反應,與其他菌沒有出現(xiàn)交叉反應,特異性良好;所制備的單增李斯特菌多克隆抗體與金黃色葡萄球菌、糞鏈球菌和粘質沙雷氏菌出現(xiàn)了交叉反應,與其他菌沒有交叉反應,特異性良好。(3)采用BCA蛋白定量試劑盒測定兩種兔多克隆抗體的蛋白含量,所提取的大腸桿菌O157:H7多克隆抗體的蛋白含量為29.06 mg·m L-1,所提取的單增李斯特菌多克隆抗體的蛋白含量為38.27mg·m L-1;采用SDS-PAGE電泳檢測兩種多克隆抗體的純度,可以觀察到明顯的重鏈條帶和輕鏈條帶,純度較高。第三部分量子點熒光生物探針的制備及表征(1)采用有機相合成法制備三種具有不同熒光發(fā)射波長的Cd Se/Zn S量子點。采用巰基丙酸作為穩(wěn)定劑,將Cd Se/Zn S量子點轉入水相,通過透射電鏡、熒光光譜和紫外光譜對合成的三種Cd Se/Zn S量子點進行表征,結果顯示,所合成的三種Cd Se/Zn S量子點的熒光發(fā)射波長分別為539 nm、583 nm和634 nm,形狀近似球形,粒徑均一,分散性好。(2)采用EDC和NHS作為偶聯(lián)劑,將三種不同發(fā)射波長的熒光量子點分別與大腸桿菌O157:H7兔多克隆抗體、單增李斯特菌兔多克隆抗體和布魯氏菌兔多克隆抗體進行偶聯(lián),制備了三種量子點熒光生物探針,通過紅外光譜、Zeta電位和熒光光譜等進行表征。紅外結果顯示,量子點的紅外譜圖發(fā)生了改變,在1550 cm-1附近出現(xiàn)了一組肽鍵官能團(-NH-CO-)的特征吸收譜帶;Zeta電位結果顯示,偶聯(lián)多克隆抗體后的量子點表面電位向正電荷方向移動;熒光光譜結果顯示,三個熒光發(fā)射峰峰形對稱,位置上相互分離,說明成功制備了三種量子點熒光生物探針。第四部分三種人獸共患病病原菌同步快速檢測方法的建立及效果評價(1)采用EDC和NHS作為偶聯(lián)劑,將羧基磁珠與三價卵黃進行偶聯(lián)制備可同時識別三種病原菌的免疫磁珠,通過紅外光譜、Zeta電位和DLS等方法進行表征,紅外光譜顯示,偶聯(lián)卵黃抗體后磁珠表面出現(xiàn)了肽鍵官能團(-NH-CO-)的特征吸收譜帶,Zeta電位結果顯示,偶聯(lián)三價卵黃抗體后的磁珠表面電位向正電荷方向移動,DLS結果顯示,偶聯(lián)卵黃抗體后磁珠的粒徑增加,以上表征結果說明三價卵黃抗體被成功偶聯(lián)于羧基磁珠表面。(2)采用所制備的免疫磁珠對待測樣品中大腸桿菌O157:H7、單增李斯特菌和布魯氏菌三種目標病原菌進行捕獲與快速分離,采用三種不同熒光發(fā)射波長的量子點熒光生物探針進行目標病原菌的檢測,對檢測過程中的反應條件進行優(yōu)化。結果顯示,免疫磁珠的最佳用量為50μL,富集時間為60 min,三種量子點熒光生物探針的最佳用量均為200μL,量子點標記時間為60 min,忽略磁分離洗滌時間,整個檢測程序需要120 min。(3)對建立的基于免疫磁分離技術和量子點熒光標記技術的三種病原菌同步快速檢測方法的檢測效果進行評價,結果顯示,該方法檢測大腸桿菌O157:H7、單增李斯特菌和布魯氏菌的最低檢測限分別為103 CFU·m L-1、103 CFU·m L-1和104 CFU·m L-1;采用加標回收實驗檢測方法的準確度,對三種病原菌的加標回收率均處于90%~110%,準確度良好;重復性實驗結果顯示,該檢測方法對三種病原菌檢測的變異系數(shù)均低于10%,說明方法的穩(wěn)定性較好;特異性實驗結果顯示,所建立的檢測方法對副溶血弧菌和粘質沙雷氏菌檢測特異性較差,對其他菌株檢測特異性較好。(4)采用建立的基于免疫磁分離技術和量子點熒光標記技術的三種病原菌同步快速檢測方法對牛奶、羊肉和白菜樣品進行檢測,當待測樣品為牛奶樣品時,大腸桿菌O157:H7、單增李斯特菌和布魯氏菌三種病原菌的最低檢出限均為103 CFU·m L-1;當待測樣品為羊肉樣品時,大腸桿菌O157:H7、單增李斯特菌和布魯氏菌三種病原菌的最低檢出限分別為104 CFU·m L-1、103 CFU·m L-1和104 CFU·m L-1;當待測樣品為白菜樣品時,大腸桿菌O157:H7、單增李斯特菌和布魯氏菌三種病原菌的最低檢出限分別為103 CFU·m L-1、104 CFU·m L-1和105 CFU·m L-1。綜上,本研究采用卵黃抗體技術、多克隆抗體技術、免疫磁分離技術和量子點熒光標記技術建立的大腸桿菌O157:H7、單增李斯特菌和布魯氏菌同步檢測方法。該方法特異性好、靈敏度高、重復性和穩(wěn)定性好、檢測時間短,能夠用于三種病原菌的同步快速定量檢測,為進一步開發(fā)多種人獸共患病病原菌同步、快速準確的檢測試劑盒奠定了基礎。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R535;R446.6

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