本文關(guān)鍵詞：miRNA-223在骨肉瘤中診斷價(jià)值及其對(duì)骨肉瘤侵襲影響的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：研究背景骨肉瘤是青少年與兒童最常見(jiàn)的原發(fā)惡性腫瘤之一,其發(fā)病部位主要累及股骨、脛骨等長(zhǎng)骨骨骺端,由于骨肉瘤惡性程度高,具有肺部轉(zhuǎn)移的高度傾向,因而,嚴(yán)重威脅著骨肉瘤患者的生存質(zhì)量。近年來(lái),隨著臨床骨肉瘤手術(shù)與化療的聯(lián)合應(yīng)用,骨肉瘤患者的生存率逐步地提高,然而,令人遺憾的是,由于缺乏早期敏感與特異性的腫瘤標(biāo)志物,骨肉瘤患者的診斷與治療往往屬于晚期階段。此外,手術(shù)后骨肉瘤患者仍出現(xiàn)腫瘤的復(fù)發(fā)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此,尋求骨肉瘤高效的、高特異性與敏感度的腫瘤標(biāo)志物,對(duì)骨肉瘤的早期診斷、術(shù)后監(jiān)測(cè)、提高骨肉瘤患者生存率和生存質(zhì)量具有重大的意義。研究目的本課題旨在探索miRNA-223在骨肉瘤中的診斷和預(yù)后價(jià)值,及其對(duì)骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。通過(guò)臨床與細(xì)胞水平研究,擬探討以下幾個(gè)問(wèn)題:1,miRNA-223在骨肉瘤組織及癌旁正常組織、骨肉瘤患者及健康體檢者外周血、骨肉瘤細(xì)胞系及正常成骨細(xì)胞中的表達(dá)水平差異;2,評(píng)價(jià)血清miRNA-223作為骨肉瘤早期診斷腫瘤標(biāo)志物的可能性;3,在細(xì)胞水平觀察miRNA-223對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲等的影響,探討其下游靶向蛋白表達(dá)差異。為了血清miRNA-223作為臨床骨肉瘤早期診斷的腫瘤標(biāo)志物,及骨肉瘤的靶向基因治療提供一定的理論基礎(chǔ)。材料與方法1,骨肉瘤組織標(biāo)本收集:選取鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科從2009年7月至2012年7月收治的100例骨肉瘤手術(shù)切除的患者,并且征得手術(shù)患者的同意。所有骨肉瘤患者均切取骨肉瘤的原發(fā)癌組織,及周邊無(wú)癌組織侵犯正常組織作為陰性對(duì)照,并且均經(jīng)過(guò)病理證實(shí)。利用qRT-PCR測(cè)定骨肉瘤患者癌組織與癌旁組織miRNA-223表達(dá)水平。此外,收集骨肉瘤患者的臨床病理信息,比較骨肉瘤患者組織miRNA-223表達(dá)水平與臨床病理特征如:腫瘤的大小、淋巴轉(zhuǎn)移情況、腫瘤浸潤(rùn)等關(guān)系。2,骨肉瘤患者血清標(biāo)本:收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科自2008年7月至2011年7月治療的112例骨肉瘤手術(shù)切除患者的外周血,并且取得患者的同意,手術(shù)前抽取患者5mL外周血。此外,抽取同期50例健康體檢者5mL外周血作為陰性對(duì)照,通過(guò)qRT-PCR比較骨肉瘤患者與健康體檢者外周血miRNA-223表達(dá)差異,應(yīng)用ROC曲線及多元生存分析,評(píng)價(jià)血清miRNA-223在骨肉瘤早期診斷及預(yù)后中的價(jià)值。3,在細(xì)胞水平,應(yīng)用qRT-PCR比較骨肉瘤細(xì)胞系與正常成骨細(xì)胞系miRNA-223表達(dá)差異。此外,在骨肉瘤細(xì)胞系通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miRNA-223,利用MTT法、劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)觀察miRNA-223對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響。此外,通過(guò)Western blot檢測(cè)miRNA-223下游靶向分子Caprin-1的蛋白水平的變化。研究結(jié)果1,miRNA-223在骨肉瘤患者組織中的表達(dá)分析利用qRT-PCR檢測(cè)miRNA-223在骨肉瘤組織及正常癌旁組織中的表達(dá)水平,結(jié)果顯示骨肉瘤組織miRNA-223表達(dá)量顯著低于癌旁正常組織,骨肉瘤癌旁正常組織miRNA-223表達(dá)量大約為骨肉瘤組織的3倍,兩組比較差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.0021)。這表明miRNA-223在骨肉瘤組織中呈現(xiàn)低表達(dá),提示miRNA-223可能參與了骨肉瘤腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。為了觀察骨肉瘤患者組織中miRNA-223呈現(xiàn)低表達(dá)模式與骨肉瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系,本研究通過(guò)比較骨肉瘤組織中miRNA-223在不同的患者性別、不同年齡、不同腫瘤大小、不同腫瘤位置、不同腫瘤組織類型、患者有無(wú)轉(zhuǎn)移情況、不同生存情況等組別中的表達(dá)差異,結(jié)果顯示死亡組、轉(zhuǎn)移組骨肉瘤組織miRNA-223表達(dá)顯著低于存活組、非轉(zhuǎn)移組(P0.05),提示miRNA-223可能在骨肉瘤轉(zhuǎn)移與患者生存中發(fā)揮重要的作用。2,miRNA-223在骨肉瘤患者外周血中的表達(dá)分析通過(guò)qRT-PCR實(shí)驗(yàn)分析比較112例骨肉瘤患者與50例正常健康體檢者血清中miRNA-223表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對(duì)于正常健康體檢者,骨肉瘤患者血清中miRNA-223表達(dá)量顯著地下調(diào),正常健康體檢者血清中miRNA-223表達(dá)量約為骨肉瘤患者的4倍,兩者比較差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01),進(jìn)一步證實(shí)了miRNA-223可能參與了骨肉瘤腫瘤的發(fā)生與惡性的進(jìn)展。為了探討血清中miRNA-223是否可以作為骨肉瘤患者的一個(gè)早期診斷標(biāo)志物,繪制ROC曲線結(jié)果顯示,ROC曲線下面積為0.956,當(dāng)根據(jù)約登數(shù)值設(shè)定截止值為1.76時(shí),miRNA-223診斷骨肉瘤患者的特異性值為89.5%,敏感度值為97.2%,提示血清miRNA-223可作為一個(gè)潛在的生物標(biāo)志物以區(qū)別骨肉瘤與健康體檢者,具有較高的組織特異性及靈敏度。多元Cox回歸分析結(jié)果顯示,血清中miRNA-223表達(dá)(RR=4.59,95%CI 1.84-11.45,P=0.001)可作為骨肉瘤患者總體生存的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后因子。3,miRNA-223在骨肉瘤細(xì)胞侵襲中作用機(jī)制的初步探討細(xì)胞水平,骨肉瘤細(xì)胞系瞬時(shí)轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)miRNA-223,應(yīng)用MTT法、劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)觀察骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的變化。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,相對(duì)于未轉(zhuǎn)染的HOS、MG-63細(xì)胞及其陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染細(xì)胞,過(guò)表達(dá)miR-223可顯著地抑制骨肉瘤細(xì)胞HOS、MG-63的增殖;劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)miR-223可明顯抑制骨肉瘤細(xì)胞HOS、MG-63的遷移;此外,Transwell實(shí)驗(yàn)顯示過(guò)表達(dá)miR-223可顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞HOS、MG-63的侵襲。胞質(zhì)激活/增殖相關(guān)蛋白1(Cytoplasmic activation/proliferation-associated protein-1,Caprin-1)是參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散率和細(xì)胞增殖率的重要蛋白。本研究中Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,相對(duì)于空白細(xì)胞與陰性轉(zhuǎn)染細(xì)胞,MG-63過(guò)表達(dá)miRNA-233后,Caprin-1蛋白表達(dá)水水平顯著地被抑制;這提示miRNA-223/Caprin-1通路可能在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。結(jié)論1,從骨肉瘤患者組織、外周血及骨肉瘤細(xì)胞系三個(gè)水平驗(yàn)證了miRNA-223在骨肉瘤中呈現(xiàn)低表達(dá)模式。2,血清miRNA-223可作為骨肉瘤患者早期有效的診斷標(biāo)志物,具有高度特異性與敏感度。此外,血清miRNA-223還可以作為骨肉瘤患者手術(shù)后病情檢測(cè)的一個(gè)指標(biāo)。3,細(xì)胞水平研究發(fā)現(xiàn)miRNA-223可抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲等生物學(xué)功能,miRNA-223可能通過(guò)調(diào)控Caprin-1進(jìn)而發(fā)揮作用。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R738.1

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本文編號(hào)：1307138