本文關(guān)鍵詞：基于β-淀粉樣多肽的檢測及其聚集體的行為機制研究

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【摘要】：阿爾茲海默癥(Alzheimer's disease,AD)是一種漸進性的神經(jīng)退行性疾病,是老年癡呆中最常見的一種類型,約占癡呆人數(shù)的60-80%。隨著人類壽命的不斷延長,其發(fā)病人數(shù)在迅速增加,給社會和家庭帶來了極大的負擔。AD已經(jīng)成為威脅老年人健康的主要疾病之一,其主要的臨床癥狀為認知功能障礙、行為異常和記憶力減退。其確切的發(fā)病機制還不是很清楚,目前還沒有有效的治療方法和藥物能夠逆轉(zhuǎn)、治愈AD。最近,研究人員發(fā)現(xiàn)淀粉樣多肽(β-Amyloid,Aβ)的沉積和清除是引起AD的主要因素。大腦中的沉積物主要由Aβ(1-40)和Aβ_(1-42)聚集組成,其早在AD發(fā)病之前的幾年或幾十年已經(jīng)開始演化。因此,Aβ濃度的變化能反映出AD疾病發(fā)展的進程�，F(xiàn)階段,Aβ(1-40)和Aβ_(1-42)已經(jīng)被確立為診斷AD的標志物,精確的檢測Aβ可為AD的早期診斷及后續(xù)治療提供重要依據(jù)。此外,Aβ發(fā)生錯誤折疊會形成不同分子量的聚合物,比如寡聚體形態(tài)的Aβ(2至4個單體)、高聚體形態(tài)的Aβ(14至50個單體)。形成后的Aβ聚合物與神經(jīng)細胞膜上的受體結(jié)合,并引發(fā)一系列突觸損傷和神經(jīng)毒性效應。然而,研究發(fā)現(xiàn)不同分子量的聚合物引起的神經(jīng)毒性效應具有差異性,其具體機制還有待進一步闡明。雙偏振極化干涉測量技術(shù)(Dual Polarization Interferometry,DPI)是一種高分辨的界面分析技術(shù),主要用于對分子間相互作用進行實時定性和定量分析�；谏鲜鲅芯勘尘�,本論文構(gòu)建了幾種Aβ的檢測體系并利用DPI研究了不同分子量的Aβ聚合物和膜受體結(jié)合時的動力學信息。1.基于抗體的特異性、銀納米粒子的光學特性以及Aβ與Cu~(2+)間的相互作用,構(gòu)建了一種檢測Aβ的比色免疫傳感器。將Aβ(1-40/1-42)的特異性抗體通過偶聯(lián)反應修飾到銀納米粒子表面,得到Antibody-AgNPs(Ab-AgNPs),此時溶液為亮黃色。將Aβ(1-40/1-42)和Cu~(2+)同時加入到Ab-AgNPs,抗體特異性結(jié)合Aβ,且Cu~(2+)與Aβ的第6、13、14位點咪唑基結(jié)合,導致Ab-AgNPs發(fā)生聚沉現(xiàn)象。隨著Aβ(1-40/1-42)濃度的增加,銀納米粒子聚沉現(xiàn)象越來越明顯,溶液由黃色逐漸變化到紅色。紫外吸收光譜的變化與Aβ(1-40/1-42)濃度(0.25-150 nM)成線性關(guān)系,檢測限(LOD,3σ/s)低至86 βM。該方法具有高靈敏度、高選擇性、可視化、經(jīng)濟、操作簡單等特點。2.利用Aβ_(1-42)的N-和C-末端兩種不同抗體和金納米粒子的光學特性,開發(fā)了一種檢測Aβ_(1-42)的比色免疫傳感器。通過離子和疏水作用,將兩端抗體(C-Antibody(1-42),C-Ab(1-42);N-Antibody(1-42),N-Ab(1-42))分別修飾到金納米粒子表面,并按照1:1比例混勻得到AuNPs@C/N-Ab(1-42)。Aβ_(1-42)加入后,由于 N-和C-末端抗體分別與Aβ_(1-42)結(jié)合而形成類似三明治結(jié)構(gòu)。隨著Aβ_(1-42)濃度的增加,AuNPs@C/N-Ab(1-42)溶液逐漸聚沉,溶液顏色從紅色逐漸到藍色變化。吸光度變化值△A與Aβ_(1-42)濃度(7.5-300 nM)呈良好的線性關(guān)系,檢測限為2.3 nM(3σ/s)。該方法不僅保持了 ELISA中固有的特征(比如定量和特異性),而且還具有可視化、方便、操作簡單等優(yōu)點。3.利用DPI技術(shù)實時探究三種不同形態(tài)的Aβ(單體Aβ_(1-42)、寡聚體Aβ_(1-42),高聚體Aβ_(1-42))與ED1D2L受體間相互作用。將ED1D2L受體通過BS3交聯(lián)劑固定在氨基化芯片表面。三種不同形態(tài)的Aβ分別流經(jīng)芯片表面,實時獲取相互作用過程中的參數(shù)信息,比如層質(zhì)量、厚度、密度的變化。通過分析層質(zhì)量的變化,首次精確測定了三種不同形態(tài)Aβ_(1-42)和ED1D2L受體(白細胞免疫球蛋白樣B2的胞外結(jié)構(gòu)域)間的結(jié)合速率(Association rate,ka)和解離速率(Dissociation rate,κd)。通過比較κa值,我們發(fā)現(xiàn)高聚體Aβ_(1-42)(1.34×105 M~(-1)·s~(-1))的結(jié)合速率比單體 Aβ_(1-42)(2.85×104 M~(-1)·s~(-1) 的結(jié)合速率快 5 倍,而寡聚體 Aβ_(1-42)(4.52×104M~(-1).s~(-1))的結(jié)合速率與單體Aβ_(1-42)基本保持一致。通過比較kd,我們發(fā)現(xiàn)單體Aβ_(1-42)(1.79× 10-2 s~(-1))和寡聚體Aβ_(1-42)(2.09 ×10-2s~(-1))的解離速度最快,其速率約為高聚體Aβ_(1-42)(5.34×10-4s~(-1))的30倍。由此說明,高聚體Aβ_(1-42)與ED1D2L受體具有很強的親和力且停留在ED1D2L受體上的時間較長,可能引起異常的下游信號傳導,進而導致一系列神經(jīng)毒性效應。根據(jù)測定的動力學參數(shù),可以幫助我們從動力學角度深入了解高聚體Aβ_(1-42)是如何在AD中引起毒性效應的,并且上述信息有可能為未來藥物的發(fā)現(xiàn)和篩選提供幫助。
【學位授予單位】：中國科學技術(shù)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R749.16;O657.3

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本文編號：1306354