本文關(guān)鍵詞：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和組蛋白甲基化在高同型半胱氨酸血癥促斑塊不穩(wěn)定中作用和機(jī)制研究

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【摘要】：目的動(dòng)脈粥樣硬化是起源于脂代謝失衡和炎癥過(guò)度激活的慢性血管壁疾病。數(shù)十年來(lái),動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)疾病已成為全球致殘、致死的首要原因。在我國(guó),隨著人民生活水平提高和飲食習(xí)慣的改變,動(dòng)脈粥樣硬化及其相關(guān)疾病的發(fā)病率也呈現(xiàn)逐年升高的趨勢(shì),成為主要的死亡原因。臨床研究表明引起急性心血管事件的主要原因是冠狀動(dòng)脈晚期粥樣硬化斑塊的突然破裂以及由此引發(fā)的血栓形成,而動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定是導(dǎo)致斑塊破裂的重要原因。因此,研究影響斑塊易損性的因素和機(jī)制,探索相應(yīng)的干預(yù)方法,對(duì)冠心病的防治具有重要的價(jià)值。數(shù)百項(xiàng)臨床觀察性研究提示同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)與動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)。尤為重要的是,臨床中已證實(shí)高同型半胱氨酸血癥是頸動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈易損斑塊形成的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。在動(dòng)脈粥樣硬化ApoE-/-小鼠模型發(fā)現(xiàn)存在高同型半胱氨酸血癥促進(jìn)斑塊不穩(wěn)定。觀察發(fā)現(xiàn)病變區(qū)富含巨噬細(xì)胞凋亡和增大的壞死核心形成是斑塊進(jìn)展的重要組織學(xué)特征。巨噬細(xì)胞凋亡貫穿動(dòng)脈粥樣硬化形成始終。與早期動(dòng)脈粥樣硬化形成不同,多個(gè)研究證實(shí)病變區(qū)巨噬細(xì)胞凋亡與不穩(wěn)定斑塊形成密切相關(guān)。但是高同型半胱氨酸血癥如何調(diào)控巨噬細(xì)胞凋亡和不穩(wěn)定斑塊形成機(jī)制不清。慢性持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活未折疊蛋白反應(yīng)促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡。但高同型半胱氨酸血癥是否通過(guò)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡和不穩(wěn)定斑塊形成,目前未見(jiàn)報(bào)道;另一方面,動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜,是環(huán)境和遺傳因素長(zhǎng)期共同作用的結(jié)果。最強(qiáng)的遺傳因素也僅能解釋大約10%的心血管發(fā)病機(jī)制。同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)是體內(nèi)轉(zhuǎn)甲基反應(yīng)的重要中間代謝產(chǎn)物,通過(guò)向DNA或蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)甲基調(diào)控基因表達(dá)。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)已證實(shí)Hcy對(duì)基因組和候選基因甲基化的調(diào)控作用。所以,通過(guò)表觀調(diào)控探索Hcy促動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要。近期,越來(lái)越多的證據(jù)顯示組蛋白甲基化在斑塊不穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用。但是,組蛋白調(diào)控在Hcy促進(jìn)不穩(wěn)定斑塊中的作用目前仍不清楚。所以,本研究中擬通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn),探討(1)巨噬細(xì)胞凋亡在Hcy促進(jìn)不穩(wěn)定斑塊形成中的作用(2)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在Hcy促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡和不穩(wěn)定斑塊形成中的機(jī)制(3)組蛋白甲基化在Hcy促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡和不穩(wěn)定斑塊形成中的作用。為臨床預(yù)防和干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊形成提供新的靶點(diǎn)。方法第一部分:8周齡雄性C57BL/6J小鼠和ApoE-/-小鼠各36只,隨機(jī)分為對(duì)照組(12只),高蛋氨酸飼養(yǎng)組(12只)和葉酸干預(yù)組(12只),對(duì)照組飼以普通AIN-93G飼料,高蛋氨酸飼養(yǎng)組飼以含1.7%蛋氨酸的AIN-93G飼料,葉酸干預(yù)組飼以含1.7%的蛋氨酸加0.0008%葉酸AIN-93G飼料,連續(xù)飼喂養(yǎng)20周。干預(yù)期滿(mǎn)后,眼球取血,處死小鼠,全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清Hcy和血脂水平。主動(dòng)脈大體染色和主動(dòng)脈竇染色評(píng)估斑塊面積和壞死核心面積,多種特殊染色評(píng)估斑塊穩(wěn)定性。TUNEL染色評(píng)估斑塊區(qū)凋亡細(xì)胞。培養(yǎng)Raw264.7巨噬細(xì)胞,在ox-LDL基礎(chǔ)上給予Hcy干預(yù),AVPI和TUNEL技術(shù)評(píng)估巨噬細(xì)胞凋亡,油紅O染色觀察巨噬細(xì)胞脂質(zhì)沉積,Western Blot檢測(cè)線粒體凋亡通路凋亡基因的表達(dá);第二部分:8周齡雄性ApoE-/-小鼠36只,分為對(duì)照組(12只),高蛋氨酸飼養(yǎng)組(12只)和4-PBA干預(yù)組(12只),對(duì)照組飼以普通AIN-93G飼料,高蛋氨酸飼養(yǎng)組飼以含1.7%蛋氨酸的AIN-93G飼料,4-PBA干預(yù)組飼以含1.7%蛋氨酸的AIN-93G飼料12周后,腹腔注射4-PBA 8周。三組小鼠總共干預(yù)20周后,眼球取血,處死小鼠,全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清Hcy和血脂水平。主動(dòng)脈大體染色和主動(dòng)脈竇染色評(píng)估斑塊面積和壞死核心面積,多種特殊染色評(píng)估斑塊穩(wěn)定性。TUNEL染色評(píng)估斑塊凋亡細(xì)胞。培養(yǎng)Raw264.7巨噬細(xì)胞,在ox-LDL基礎(chǔ)上給予Hcy和4-PBA干預(yù),AVPI和TUNEL技術(shù)評(píng)估巨噬細(xì)胞凋亡,油紅O染色觀察巨噬細(xì)胞脂質(zhì)沉積,Western Blot檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激因子和線粒體凋亡通路凋亡基因的表達(dá);第三部分:使用第一部分實(shí)驗(yàn)的ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈標(biāo)本,免疫組化和Western Blot檢測(cè)主動(dòng)脈H3K4m2和H3K9m2的表達(dá)。培養(yǎng)Raw264.7巨噬細(xì)胞,在ox-LDL基礎(chǔ)上給予Hcy、組蛋白抑制劑BIX01294和葉酸干預(yù),AVPI和TUNEL檢測(cè)巨噬細(xì)胞凋亡,油紅O染色觀察巨噬細(xì)胞脂質(zhì)沉積,Western Blot檢測(cè)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶G9a和SUV39H1的表達(dá)和線粒體凋亡途徑基因的表達(dá)。結(jié)果我們觀察到:第一部分(1)20周高蛋氨酸飲食成功誘導(dǎo)了Hhcy,但對(duì)血脂無(wú)明顯影響;(2)單純高蛋氨酸飲食不能誘發(fā)C57BL/6J小鼠發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化斑塊;(3)高蛋氨酸飲食誘導(dǎo)的Hhcy ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈斑塊面積和壞死核心面積增大;(4)高蛋氨酸飲食誘導(dǎo)的Hhcy促進(jìn)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定;(5)高蛋氨酸飲食誘導(dǎo)的Hhcy促進(jìn)ApoE-/-小鼠斑塊區(qū)細(xì)胞凋亡;(6)Hcy促進(jìn)Raw264.7巨噬細(xì)胞脂質(zhì)沉積和泡沫化;(7)Hcy促進(jìn)Raw264.7巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡;(8)Hcy促進(jìn)Raw264.7巨噬細(xì)胞Cleaved caspase3,Bax表達(dá),抑制Bcl-2表達(dá);第二部分:(9)4-PBA改善Hhcy誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈斑塊進(jìn)展和壞死核心增大,抑制斑塊不穩(wěn)定;(10)4-PBA減緩高蛋氨酸飲食誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈斑塊細(xì)胞凋亡;(11)4-PBA抑制Hcy誘導(dǎo)的Raw264.7巨噬細(xì)胞脂質(zhì)沉積和凋亡;(12)高蛋氨酸飲食誘導(dǎo)的Hhcy促進(jìn)小鼠主動(dòng)脈組織ERS因子表達(dá)升高。4-PBA具有拮抗作用;(13)Hcy促進(jìn)Raw264.7巨噬細(xì)胞ERS因子表達(dá)升高。4-PBA具有拮抗作用;(14)4-PBA能夠改善Hcy誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞Bcl-2途徑凋亡因子變化;(15)高蛋氨酸飲食誘導(dǎo)的Hhcy抑制ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈斑塊H3K9m2表達(dá),但對(duì)H3K4m2表達(dá)無(wú)明顯影響;(16)Hcy調(diào)控Raw264.7巨噬細(xì)胞組蛋白H3K9m2和組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶G9a表達(dá);(17)組蛋白H3K9m2參與調(diào)控Hcy誘導(dǎo)的體外巨噬細(xì)胞泡沫化;(18)組蛋白H3K9m2調(diào)控Hcy誘導(dǎo)的Raw264.7巨噬細(xì)胞凋亡;(19)組蛋白H3K9m2調(diào)控線粒體凋亡通路基因的表達(dá)。結(jié)論一、Hhcy通過(guò)巨噬細(xì)胞凋亡促進(jìn)不穩(wěn)定斑塊形成;二、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在Hcy促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡和不穩(wěn)定斑塊形成中發(fā)揮重要作用;三、組蛋白H3K9m2參與Hcy介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡和斑塊不穩(wěn)定。
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R54

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本文編號(hào)：1306315