本文關(guān)鍵詞：神經(jīng)系統(tǒng)seipin缺失對Aβ細胞毒作用的影響及其機制研究

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【摘要】：先天性全身脂肪營養(yǎng)不良II型(congenital generalized lipodystrophy type 2,CGL2)的臨床特征是全身脂肪組織減少和脂糖代謝異常,伴有認知功能障礙或精神發(fā)育遲滯。11號染色體長臂的seipin基因無義突變(seipin缺失)被認為是CGL2的主要病理機制。原位雜交和免疫染色的檢測結(jié)果顯示,seipin在大腦皮層、海馬、下丘腦、腦干和小腦等腦區(qū)選擇性高表達。海馬錐體神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細胞大量表達seipin蛋白。通過構(gòu)建神經(jīng)系統(tǒng)選擇性seipin基因敲除(seipin-KO)小鼠,我們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元的seipin缺失并沒有改變腦的結(jié)構(gòu),也沒有減少海馬錐體神經(jīng)元數(shù)量。我們課題組最近的研究已報道,seipin缺失抑制過氧化物酶體增殖物激活受體 γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)的表達。PPARγ是一種配體激活型轉(zhuǎn)錄因子。有研究報道,PPARy下調(diào)可以增強腦內(nèi)神經(jīng)細胞的炎性反應(yīng)。阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種以記憶喪失和認知功能衰退為主要臨床癥狀的神經(jīng)退行性疾病。AD腦的PPARy水平明顯減少,PPARy激動劑能減輕β-淀粉樣蛋白(β-amyloid,Aβ)誘導的神經(jīng)炎癥和細胞損害。此外,AD腦中PPARγ介導的抗炎作用受到越來越多的關(guān)注�；谝陨戏治�,我提出"神經(jīng)系統(tǒng)seipin缺失引起的PPARγ表達下調(diào)有可能會增強Aβ的神經(jīng)毒性作用"的科研設(shè)想。研究目的本研究將重點探討神經(jīng)系統(tǒng)seipin缺失對Aβ誘導神經(jīng)炎癥和細胞毒性的影響及其分子機制。實驗方法(1)動物模型的制備和鑒定:神經(jīng)系統(tǒng)seipin-KO小鼠模型由北京大學醫(yī)學院劉國慶教授提供。提取尾部DNA,用PCR方法鑒定基因型。(2)AD動物模型的制備:選取16周齡seipin-KO和野生型(wild-type,WT)雄性小鼠,采用聚集態(tài) Aβ25-35(1.2nmol/2μl)或 Aβ142(0.1nmol/2μl)進行側(cè)腦室注射。實驗小鼠分組:WT小鼠,注射Aβ25-35的WT(Aβ25-35-WT)小鼠,注射Aβ142的WT(Aβ1-42-WT)小鼠,seipin-KO小鼠,注射Aβ25-35的seipin-K(Aβ25-35-seipin-KO)小鼠和注射 Aβ1-42 的seipin-KO(Aβ1-42-seipIn-KO)小鼠。對照組小鼠側(cè)腦室內(nèi)注射相同容積的溶劑。(3)動物行為學檢測:采用Morris水迷宮和Y迷宮實驗評估小鼠的空間認知功能。(4)用甲苯胺藍染色來進行海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元計數(shù)。(5)用GFAP或Iba1與seipin進行免疫組織雙染色以確定seipin在星型膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞中的表達。進行海馬CA1區(qū)GFAP或Iba1陽性細胞計數(shù)。(6)用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測海馬的神經(jīng)炎性因子白介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平。(7)用蛋白免疫印記方法來檢測海馬的糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthasekinase-3β,GSK-3β)Tyr216位點磷酸化和Ser9位點磷酸化水平、信號傳導子和轉(zhuǎn)錄激活子(signal transducer and activator of transcription,STAT)3蛋白和磷酸化水平、PPARγ蛋白水平。實驗結(jié)果(1)與WT小鼠相比,seipin-KO小鼠在Morris水迷宮實驗中登臺潛伏期明顯延長,撤臺后在目標象限時間減少,以及在Y迷宮的進臂交替率降低——提示神經(jīng)系統(tǒng)seipin缺失導致認知功能減退。(2)用低劑量Aβ25-35(1.2 nmol/2μl)進行側(cè)腦室注射沒有改變WT小鼠在Morris 水迷宮的登臺潛伏期和目標象限的停留時間,以及在Y迷宮的進臂交替率,但是進一步加重了 seipin-KO小鼠在Morris水迷宮的登臺潛伏期延長和撤臺后目標象限停留時間的減少,以及Y迷宮進臂交替率的降低——提示seipin缺失能加重Aβ誘導的認知功能損害。(3)與WT小鼠相比,seipin-KO小鼠海馬PPARy蛋白水平明顯減少。PPARy激動劑羅格列酮處理不僅能改善seipin-KO小鼠的空間認知功能,還能阻止Aβ25-35/1-42處理seipin-KO(Aβ25-35/1-42-seiPIn-KO)小鼠發(fā)生認知功能損害——提示seipin缺失通過減少PPARγ增強Aβ對認知功能的損害作用。(4)與WT小鼠相比,seipin-KO小鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元數(shù)量沒有明顯改變。低劑量Aβ25-35或Aβ1-2(0.1 nmol/2μl)側(cè)腦室注射引起seipin-KO小鼠發(fā)生大約30-35%錐體神經(jīng)元丟失和Hoechst染色陽性細胞增加,但是沒有減少WT小鼠的錐體神經(jīng)元數(shù)量。羅格列酮處理能減少Aβ25-35或Aβ1-42誘導seipin-KO小鼠的錐體神經(jīng)元死亡。PPARγ阻斷劑GW9962能拮抗羅格列酮對Aβ25-35誘導錐體神經(jīng)元死亡的保護作用——提示seipin缺失通過減少PPARγ增強Aβ神經(jīng)毒性作用。(5)在WT小鼠,海馬CA1區(qū)星型膠質(zhì)細胞表達seipin,而小膠質(zhì)細胞不表達seipin。與WT小鼠相比,seipin-KO小鼠海馬CA1區(qū)星型膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞數(shù)量沒有明顯改變,但是炎性因子IL-6和TNF-α 水平有增加。羅格列酮處理能抑制seipin-KO小鼠IL-6和TNF-α水平增加。GW9962又能拮抗羅格列酮的抗炎作用——提示seipin缺失通過減少PPARγ誘導神經(jīng)炎性反應(yīng)。(6)低劑量Aβ25-35或Aβ1-42側(cè)腦室注射引起seipin-KO小鼠星型膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞數(shù)量增加,并且進一步提高seipin-KO小鼠IL-6和TNF-α水平,但是不影響WT小鼠的星型膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞數(shù)量、IL-6和TNF-α水平。同樣,羅格列酮處理能抑制Aβ25-35或Aβ1-42誘導的seipin-KO小鼠星型膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞數(shù)量以及IL-6和TNF-α水平增加。GW9962也能阻止羅格列酮對Aβ25-35誘導炎性反應(yīng)的拮抗作用——提示seipin缺失通過減少PPARγ能增強Aβ的致炎作用。(7)與WT小鼠相比,seipin-KO小鼠海馬GSK-3β在Tyr216位點的磷酸化水平升高和在Ser9位點的磷酸化水平降低,提示GSK-3β活性增強。羅格列酮處理能修正seipin-KO小鼠GSK-3β活性增強。Aβ25-35能提高WT小鼠的GSK-3β在Ser9位點的磷酸化水平。Seipin-KO小鼠海馬的STAT3磷酸化水平高于WT小鼠,但是羅格列酮處理進一步增加了seipin-KO小鼠STATT3磷酸化——提示seipin缺失通過減少PPARγ能增加GSK-3β活性。結(jié)論Seipin缺失通過減少星型膠質(zhì)細胞的PPARy能提高GSK-3β活性,增加IL-6及TNF-α的產(chǎn)生和釋放,促進Aβ誘導的神經(jīng)炎癥和細胞毒性作用,引起認知功能損害。臨床意義本研究的結(jié)果提示CGL2患者的認知功能障礙可能與PPARγ水平降低有關(guān),因此,PPARγ激動劑有可能會改善CGL2患者的認知功能。
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R749.16

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