本文關(guān)鍵詞：益氣養(yǎng)陰法中藥防治非小細胞肺癌轉(zhuǎn)移的系統(tǒng)評價及其分子機制研究

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【摘要】：研究背景肺癌是當今臨床中最為常見的惡性腫瘤,且其發(fā)病率仍在逐年上升,國內(nèi)外的致死率也是居高不下。在肺癌的分型中,非小細胞肺癌(NSCLC)約占肺癌總數(shù)的80%～85%,手術(shù)切除仍是目前NSCLC最有效且最好的方法,但僅僅只有20%NSCLC患者適宜手術(shù)治療。目前按照最新的NCCN指南,NSCLC術(shù)后應(yīng)予常規(guī)的輔助化療,以鉑類為基礎(chǔ)的術(shù)后輔助化療目前已成為早期和中期患者的主要治療方法,諸多臨床研究也已表明化療能夠起一定程度上到延長生存期、抑制瘤體生長的作用。但對于遠期控制復發(fā)轉(zhuǎn)移、延長無病生存期以及改善患者癥狀及生存質(zhì)量方面,中醫(yī)藥的優(yōu)勢還是非常明顯的。惡性腫瘤的病因病機復雜,氣、血、痰、瘀、毒、虛等致病因素可以大致概括癌病的中醫(yī)病機。對于大多數(shù)非小細胞肺癌病人來講,一般發(fā)現(xiàn)便已是中晚期,病程遷延日久正氣虛損,故氣陰兩虛的證候體現(xiàn)是最為明顯的。因此益氣養(yǎng)陰法中藥治療是對于NSCLC患者一個有效的治療方案,而結(jié)合國際上公認的化療方案進行中西醫(yī)結(jié)合治療是目前最為常用的方法,也取得了比較明顯的療效。在益氣養(yǎng)陰法中藥當中,肺瘤平膏作為臨床及基礎(chǔ)實驗均研究較多的藥物,其防治肺癌轉(zhuǎn)移的效果已被廣泛認可,但是對其分子機制的研究還不夠深入。目前最新研究認為,腫瘤微環(huán)境可以改變腫瘤轉(zhuǎn)移的潛能,因而從微觀整體性方面來調(diào)控腫瘤微環(huán)境以防治腫瘤轉(zhuǎn)移的方法越來越受到各方面重視。腫瘤微環(huán)境的兩大核心是免疫與炎癥,微環(huán)境內(nèi)癌成分及非癌成分各自發(fā)揮著促進腫瘤轉(zhuǎn)移及抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移的不同作用,而益氣養(yǎng)陰法中藥肺瘤平膏究竟在此系統(tǒng)內(nèi)發(fā)揮著怎樣的作用也是值得研究的。因此,本研究實驗部分建立腫瘤免疫-炎性共培養(yǎng)模型,制備肺瘤平膏含藥血清,觀察其是否對微環(huán)境內(nèi)癌成分(LL/2-luc-M38細胞)與非癌成分(DC、RAW264.7細胞)中的關(guān)鍵信號通路PI3K/AKT/NF-κB的表達起到不同的調(diào)節(jié)作用,從而達到防治肺癌轉(zhuǎn)移的作用。研究目的1.旨在分析評價益氣養(yǎng)陰法中藥在非小細胞肺癌患者中的療效和安全性及應(yīng)用前景。2.選用益氣養(yǎng)陰法的代表藥物肺瘤平膏進行實驗研究,探討其對于腫瘤免疫-炎性微環(huán)境中的癌成分與非癌成分的調(diào)節(jié)作用,觀察其是否對微環(huán)境內(nèi)兩種成分的關(guān)鍵信號通路PI3K/AKT/NF-κB的表達起到雙向調(diào)節(jié)作用,從而探討其預防肺癌轉(zhuǎn)移的分子機制。研究方法1.本研究前半部分采用系統(tǒng)評價方法,對益氣養(yǎng)陰中藥療法治療NSCLC患者的療效及安全性進行有效的評價。運用Cochrane協(xié)作網(wǎng)的系統(tǒng)評價方法進行匯總分析,查閱國內(nèi)外知名的幾大文獻數(shù)據(jù)庫,搜集益氣養(yǎng)陰法治療NSCLC的隨機對照臨床研究文獻,運用Revman軟件作定量合并分析(meta分析),并最終評價益氣養(yǎng)陰法在治療中晚期非小細胞肺癌中的地位及為其療效和安全性提供依據(jù)。2.本研究實驗部分選用了在臨床中已廣泛應(yīng)用的益氣養(yǎng)陰法代表中成藥肺瘤平膏作為實驗藥物,進行體內(nèi)體外實驗。(1)通過體內(nèi)實驗利用流式細胞儀檢測肺瘤平膏對Lewis肺癌荷瘤小鼠免疫功能的影響:首先對觀察肺瘤平膏對Lewis肺癌荷瘤小鼠脾臟DC的調(diào)節(jié)作用,然后研究其對Lewis肺癌荷瘤小鼠脾臟TAM亞型的調(diào)節(jié)作用(2)建立小鼠髓系樹突狀細胞(DC)體外培養(yǎng),并通過光鏡、電鏡進行形態(tài)學鑒定以及流式細胞儀檢測其生物學特征。然后進行肺瘤平膏含藥血清的制備,為體外實驗做準備。(3)利用流式細胞儀研究肺瘤平膏含藥血清對腫瘤免疫及炎性微環(huán)境中的非癌成分(DC及RAW264.7細胞)表型的影響:包括肺瘤平膏含藥血清對C57BL/6小鼠髓系DC表型的影響及肺瘤平膏含藥血清對RAW264.7細胞數(shù)量及表型的影響。(4)通過Western blot與實時定量熒光PCR方法,研究肺瘤平膏含藥血清對腫瘤免疫及炎性微環(huán)境中癌成分與非癌成分PI3K/AKT/NF-κB表達的影響:首先建立腫瘤免疫共培養(yǎng)微環(huán)境,觀察肺瘤平膏含藥血清對免疫共培養(yǎng)微環(huán)境中LL/2-luc-M38細胞與髓系DC中PI3K/AKT/NF-κB表達的影響;其次建立腫瘤炎性共培養(yǎng)微環(huán)境,觀察肺瘤平膏含藥血清對炎性共培養(yǎng)微環(huán)境中LL/2-luc-M38細胞與RAW264.7細胞中PI3K/AKT/NF-κB表達的影響。最終研究肺瘤平膏含藥血清是否對腫瘤細胞(癌成分)與DC、RAW264.7細胞(非癌成分)中的關(guān)鍵信號通路PI3K/AKT/NF-κB起著雙向調(diào)節(jié)作用。研究結(jié)果1.從系統(tǒng)評價的最終結(jié)果來分析,益氣養(yǎng)陰法中藥聯(lián)合化療治療非小細胞肺癌對比單獨應(yīng)用化療,在近期有效率的提升、生存質(zhì)量的改善、骨髓毒性反應(yīng)的降低及中醫(yī)癥候的改善方面均有明顯效果,其差異均具有統(tǒng)計學意義。2.肺瘤平膏含藥血清對腫瘤免疫及炎性微環(huán)境中非癌成分的影響:肺瘤平膏對Lewis肺癌荷瘤小鼠脾臟DC及脾臟TAM亞型的調(diào)節(jié)作用:脾臟DC在單純荷瘤的小鼠中(Model組)數(shù)量由4.26%逐漸降低到2.59%,FLP組(肺瘤平膏灌胃)小鼠的DC數(shù)量在14d、21d、28d,分別為5.39%、4.83%、4.15%。相對于DC的低數(shù)量而言,M1、M2巨噬細胞及其比值在上述兩組中均相對較高。M1型巨噬細胞(Model組)數(shù)量由8.59%逐漸上升到25.98%,同時M2型數(shù)量由0.92%逐漸上升到5.42%,M1/M2由9.34下降至4.79;對于FLP組荷瘤小鼠,在21d時,兩型巨噬細胞數(shù)量分別為23.16%及2.77%,數(shù)值較高,而M1/M2比值分別在3個日期時則分別為7.86、8.36、9.62。3.肺瘤平膏含藥血清對C57BL/6小鼠髓系DC表型的影響:觀察流式細胞儀顯示DC所表達的CD11c、MHCII類分子中,CD11c/MHC-II為70.59%、CD11c/CD80為66.01%(肺瘤平膏組),其與空白組相比較有統(tǒng)計學差異(P0.01);肺瘤平膏含藥血清對RAW264.7巨噬細胞數(shù)量及表型的影響:RAW264.7細胞在經(jīng)過IL-4處理后通過流式細胞儀觀察:肺瘤平膏血清組M1/M2的比例較空白組明顯升高(5.25),F4/80-CD16/32及F4/80-CD206的比例分別為12.14%、2.31%,與空白組相比下降程度有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.肺瘤平膏含藥血清在免疫共培養(yǎng)微環(huán)境中的對于癌成分與非癌成分中的PI3K/AKT/NF-κB表達的不同影響:運用Western blot及實時定量熒光PCR方法檢測:LL/2-luc-M38在腫瘤-免疫共培養(yǎng)環(huán)境中,PI3K、AKT、NF-κB的蛋白與基因的表達被肺瘤平膏含藥血清組(FLP-S)所抑制,而其對于NF-κB的抑制最為明顯;DC細胞在腫瘤-免疫共培養(yǎng)環(huán)境中,其PI3K、AKT、NF-κB的蛋白與基因的表達能夠被FLP-S促進,而其對于PI3K表達最為明顯。肺瘤平膏含藥血清在炎性共培養(yǎng)微環(huán)境中癌成分與非癌成分中的PI3K/AKT/NF-κB表達的不同影響:LL/2-luc-M38在腫瘤-炎性共培養(yǎng)環(huán)境中,PI3K、AKT、NF-κB的蛋白及mRNA基因的表達均能夠被肺瘤平膏含藥血清(FLP-S)所抑制,而其對于PI3K、NF-κB的抑制最為明顯;RAW264.7細胞在此共培養(yǎng)環(huán)境中,PI3K、AKT、NF-κB的mRNA基因表達及AKT、NF-κB蛋白表達均被均FLP-S所促進,以NF-κB的基因提升最為明顯(P0.01),僅有PI3K的蛋白表達較前降低。研究結(jié)論1.益氣養(yǎng)陰法中藥對于非小細胞肺癌的治療作用還是值得肯定的,其聯(lián)合化療的治療方案在生存期、毒副反應(yīng)、生存質(zhì)量、中醫(yī)癥候改善等方面均較單獨化療有明顯的優(yōu)勢。因此,今后無論從安全性或是療效方面來看,益氣養(yǎng)陰法中藥是值得繼續(xù)在臨床中推廣應(yīng)用的。2.肺瘤平膏對于腫瘤微環(huán)境中非癌成分的影響主要在于對樹突狀細胞及巨噬細胞的數(shù)量的調(diào)節(jié)作用,使荷瘤小鼠的免疫系統(tǒng)處于平衡穩(wěn)定的狀態(tài)。3.肺瘤平膏含藥血清可以提高髓系DC的數(shù)量,并且可以促進髓系DC的發(fā)育。從肺瘤平膏含藥血清對RAW264.7細胞的活化方向來看,其并不是僅抑制M2型巨噬細胞,而且對M1型巨噬細胞也有抑制作用,其在調(diào)節(jié)M1、M2的同時,以抑制M2型巨噬細胞為優(yōu)勢明顯。4.肺瘤平膏含藥血清對腫瘤微環(huán)境中的癌成分與非癌成分中起平衡調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵信號通路PI3K/AKT/NF-κB的表達具有不同的雙向調(diào)節(jié)作用,其中NF-κB分子在肺瘤平膏含藥血清對于腫瘤-炎性共培養(yǎng)環(huán)境中的調(diào)節(jié)作用中占主導地位。其對于微環(huán)境中的腫瘤細胞成分及非癌成分中具有促進功能的成分均具有抑制其發(fā)展轉(zhuǎn)移的作用,而對于非癌成分部分則總體上具有促進作用。因此從整體實驗結(jié)果來講,肺瘤平膏含藥血清對微環(huán)境的調(diào)控,可能最主要是具有平衡癌成分與非癌成分的作用。
【學位授予單位】：中國中醫(yī)科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R273

【參考文獻】

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本文編號：1306109