本文關(guān)鍵詞：SM-1聯(lián)合氟尿嘧啶對(duì)人肝癌細(xì)胞及結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制研究

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【摘要】：惡性腫瘤是一類(lèi)嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命健康的疾病。在各種疾病中,惡性腫瘤的死亡率高居第二位,僅次于心腦血管病。其中肝癌和結(jié)直腸癌分別位列惡性腫瘤發(fā)病率的第三、第四位。臨床上針對(duì)此類(lèi)實(shí)體瘤主要以手術(shù)、介入治療及大劑量化療為主,但傳統(tǒng)化療藥物的長(zhǎng)期應(yīng)用使腫瘤細(xì)胞耐藥現(xiàn)象越來(lái)越普遍,這大大影響了化療藥物的臨床應(yīng)用。因此,解決化療中的耐藥問(wèn)題和優(yōu)化化療方案顯得尤為必要。同時(shí)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多基因、多因素和多階段參與的復(fù)雜病理過(guò)程,單一療法通常不能取得滿意效果,綜合治療是目前腫瘤治療的主要研究方向。5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)是嘧啶類(lèi)抗代謝藥,在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為5-氟脫氧尿嘧啶核苷酸(Fd UMP),抑制胸苷酸合成酶(TS)的活性,進(jìn)而阻斷脫氧尿嘧啶核苷酸(dUMP)轉(zhuǎn)變?yōu)槊撗跣叵汆奏ず塑账?dTMP),干擾DNA合成。5-FU對(duì)消化道腫瘤及其他實(shí)體瘤有良好療效。其缺點(diǎn)是缺乏對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性、毒性大、副作用多、久用易耐藥等。Caspase家族屬于半胱氨酸天冬氨酸-特異性蛋白酶,其家族成員在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起重要作用。其中caspase-3做為細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的終末剪切酶,負(fù)責(zé)整個(gè)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程的最終實(shí)施。正常情況下,胞質(zhì)內(nèi)caspase-3以無(wú)活性的酶原形式存在(procaspase-3),只有當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)才被激活為有活性的caspase-3。腫瘤細(xì)胞的抗凋亡特性,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)procaspase-3含量顯著高于正常細(xì)胞,因此,靶向于procaspase-3藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞具有理想的選擇性。半胱氨酸蛋白酶原活化物-1(簡(jiǎn)稱(chēng)PAC-1),在體外能夠迅速活化procaspase-3為caspase-3并引起腫瘤細(xì)胞凋亡,并且對(duì)多種體內(nèi)皮下移植瘤具有較好的抑制作用。SM-1為PAC-1的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物,具有較好的抗腫瘤活性,有望成為新的靶向procaspase-3的抗腫瘤藥物。本課題旨在研究靶向藥物SM-1與化療藥物5-FU聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人肝癌細(xì)胞及結(jié)腸癌細(xì)胞在體內(nèi)外的協(xié)同抑制作用,并探討其可能的作用機(jī)制。從而為兩藥聯(lián)合應(yīng)用提供依據(jù)。具體研究?jī)?nèi)容如下:第一部分sm-1聯(lián)合氟尿嘧啶對(duì)人肝癌細(xì)胞及結(jié)腸癌細(xì)胞的體外增殖抑制作用目的:考察5-fu聯(lián)合sm-1對(duì)人肝癌細(xì)胞株hepg2、mhcc97h、lm3,人結(jié)腸癌細(xì)胞株hct116、lovo的體外增殖抑制作用。方法:1采用mtt法測(cè)定5-fu、sm-1單獨(dú)應(yīng)用及二者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)對(duì)人肝癌細(xì)胞株hepg2、mhcc97h、lm3,人結(jié)腸癌細(xì)胞株hct116、lovo的抑制率。2依據(jù)chou-talalay中效原理,以聯(lián)合給藥分析軟件calcusyn2.1計(jì)算協(xié)同作用指數(shù)(ci)值,評(píng)價(jià)聯(lián)合作用效果。結(jié)果:1mtt結(jié)果顯示5-fu、sm-1單藥對(duì)人肝癌細(xì)胞株hepg2、mhcc97h、lm3的抑制作用具有濃度依賴性。二者聯(lián)合作用72h后,細(xì)胞抑制率明顯升高,抑制作用增強(qiáng)。應(yīng)用calcusyn2.1軟件分析協(xié)同效果,二者在很大范圍內(nèi)具有協(xié)同作用。2mtt結(jié)果顯示5-fu、sm-1單藥對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株hct116、lovo的抑制作用具有濃度依賴性。二者聯(lián)合作用72h后,細(xì)胞抑制率明顯升高,抑制作用增強(qiáng)。應(yīng)用calcusyn2.1軟件分析協(xié)同效果,二者在很大范圍內(nèi)具有協(xié)同作用。結(jié)論:5-fu和sm-1聯(lián)合給藥對(duì)人肝癌細(xì)胞株hepg2、mhcc97h、lm3,人結(jié)腸癌細(xì)胞hct116、lovo的增殖表現(xiàn)出協(xié)同抑制作用。第二部分sm-1聯(lián)合氟尿嘧啶對(duì)人肝癌細(xì)胞及結(jié)腸癌細(xì)胞抑制作用的機(jī)制研究目的:考察5-fu聯(lián)合sm-1對(duì)人肝癌細(xì)胞株hepg2、mhcc97h、lm3,人結(jié)腸癌細(xì)胞株hct116、lovo協(xié)同抑制的作用機(jī)制。方法:1hochest33342染色觀察聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響。2annexinv/pi考察聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。3jc-1檢測(cè)聯(lián)合用藥對(duì)線粒體膜電位的影響。4熒光定量pcr檢測(cè)凋亡相關(guān)rna:bax、bcl-2、survivin、xiap以及parp。5westernblot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白:caspase-3、bcl-2、bax、survivin及parp。6transwell及劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響。結(jié)果:1hochest33342染色結(jié)果顯示,5-fu聯(lián)合sm-1組細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡特征,較單藥處理組及對(duì)照組相比,有更多的典型凋亡細(xì)胞出現(xiàn)。2annexinv/pi雙染結(jié)果顯示,聯(lián)合處理組細(xì)胞凋亡率較單獨(dú)給藥組明顯增加。3jc-1檢測(cè)結(jié)果顯示,聯(lián)合給藥組細(xì)胞表現(xiàn)出綠色熒光增強(qiáng),紅色熒光減弱,線粒體膜電位較單獨(dú)給藥組顯著降低。4熒光定量pcr結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,各處理組中bax和parp基因表達(dá)顯著升高,其中聯(lián)合給藥組升高最顯著。bcl-2、survivin、xiap基因表達(dá)顯著降低,聯(lián)合給藥組降低最明顯。5westernblot結(jié)果顯示:caspase-3蛋白在單藥組及聯(lián)合組的表達(dá)顯著高于對(duì)照組,且聯(lián)合給藥組表達(dá)明顯高于單藥組。各處理組bcl-2及survivin蛋白表達(dá)較對(duì)照組低,且兩藥聯(lián)合應(yīng)用后蛋白表達(dá)較單藥組明顯降低。各處理組bax、parp蛋白表達(dá)較對(duì)照組增加,且聯(lián)合給藥組bax及parp蛋白表達(dá)也較單藥組明顯增加。6transwell及劃痕實(shí)驗(yàn)顯示聯(lián)合用藥顯著降低肝癌細(xì)胞hepg2的侵襲和遷移能力。結(jié)論:5-fu和sm-1聯(lián)合給藥對(duì)人肝癌細(xì)胞株hepg2、mhcc97h、lm3,人結(jié)腸癌細(xì)胞株hct116、lovo的凋亡具有協(xié)同作用。協(xié)同誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制可能是通過(guò)活化caspase-3,上調(diào)bax/bcl-2比例,下調(diào)survivin、xiap來(lái)實(shí)現(xiàn)的。第三部分sm-1聯(lián)合氟尿嘧啶對(duì)人肝癌細(xì)胞及結(jié)腸癌細(xì)胞抑制作用的體內(nèi)研究目的:建立人肝癌細(xì)胞裸鼠原位腫瘤模型和人結(jié)腸癌細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型考察5-fu聯(lián)合sm-1的體內(nèi)抗腫瘤效果。方法:1建立人肝癌細(xì)胞hepg2、mhcc97h裸鼠肝原位模型,給藥結(jié)束后頸部脫臼處死動(dòng)物,解剖取出瘤塊,稱(chēng)重。通過(guò)瘤重反應(yīng)5-fu、sm-1及二者聯(lián)合應(yīng)用的體內(nèi)抗腫瘤作用效果。通過(guò)觀察裸鼠的行為、活動(dòng)及體重的變化來(lái)評(píng)估用藥的安全性。2活體生物發(fā)光成像。建立穩(wěn)定表達(dá)pcdh-gfp-luc的lm3-gfp/luc細(xì)胞。建立lm3-gfp/luc細(xì)胞裸鼠肝原位模型,通過(guò)小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)采集腫瘤自發(fā)熒光信號(hào)變化趨勢(shì)及瘤重來(lái)考察5-fu、sm-1及二者聯(lián)合應(yīng)用的體內(nèi)抗腫瘤作用效果。通過(guò)觀察裸鼠的行為、活動(dòng)及體重的變化來(lái)評(píng)估用藥的安全性。3建立人結(jié)腸癌細(xì)胞hct116、lovo裸鼠皮下移植瘤模型,分組給藥,每三天稱(chēng)體重、測(cè)量腫瘤體積。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后頸部脫臼處死動(dòng)物,解剖取出瘤塊稱(chēng)重。通過(guò)腫瘤體積的變化趨勢(shì)及瘤重來(lái)比較5-fu、sm-1及二者聯(lián)合應(yīng)用的體內(nèi)抗腫瘤作用效果。通過(guò)觀察裸鼠的行為、活動(dòng)及體重的變化來(lái)評(píng)估用藥的安全性。4腫瘤組織經(jīng)石蠟包埋、切片,通過(guò)he染色、觀察病理變化。結(jié)果:15-fu、sm-1及二者聯(lián)合用藥均可對(duì)hepg2、mhcc97h裸鼠原位移植瘤生長(zhǎng)起到抑制作用。其中,聯(lián)合給藥對(duì)瘤重的抑制率最高,分別達(dá)到70.07%和86.74%。與對(duì)照組相比,5-fu、sm-1單獨(dú)給藥及二者聯(lián)合給藥均未對(duì)荷瘤裸鼠的行為、活動(dòng)及體重產(chǎn)生明顯影響。25-fu、sm-1及二者聯(lián)合用藥均可對(duì)lm3-gfp/luc裸鼠原位移植瘤生長(zhǎng)起到抑制作用,其中,5-fu聯(lián)合sm-1給藥對(duì)瘤重的抑制率最高,達(dá)到75.11%。小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)顯示,聯(lián)合給藥組腫瘤的自發(fā)熒光強(qiáng)度顯著低于對(duì)照組(p0.05)。與對(duì)照組相比,5-fu、sm-1單獨(dú)給藥及二者聯(lián)合給藥均未對(duì)荷瘤裸鼠的行為、活動(dòng)及體重產(chǎn)生明顯影響。35-fu、sm-1及二者聯(lián)合用藥均可對(duì)hct116、lovo裸鼠移植瘤生長(zhǎng)起到抑制作用,其中,5-fu聯(lián)合sm-1給藥對(duì)腫瘤體積及瘤重的抑制率最高,對(duì)于hct116模型,瘤體積抑制率達(dá)到70.42%,瘤重抑制率為69.14%。對(duì)于lovo模型,瘤體積抑制率達(dá)到78.07%,瘤重抑制率為73.09%。與對(duì)照組相比,5-fu、sm-1單獨(dú)給藥及二者聯(lián)合給藥均未對(duì)荷瘤裸鼠的行為、活動(dòng)及體重產(chǎn)生明顯影響。4 HE染色結(jié)果顯示:對(duì)照組腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。5-FU組、SM-1組及聯(lián)合給藥組腫瘤細(xì)胞均呈現(xiàn)不同程度的皺縮變圓、核固縮,以聯(lián)合給藥組的腫瘤細(xì)胞破壞最嚴(yán)重,凋亡最明顯。結(jié)論:5-Fu和SM-1聯(lián)合給藥對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2、MHCC97H、LM3-GFP/Luc裸鼠原位腫瘤模型及人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、LoVo裸鼠皮下移植瘤模型的生長(zhǎng)具有協(xié)同抑制作用。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R96

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本文編號(hào)：1305494