本文關(guān)鍵詞：SM-1聯(lián)合氟尿嘧啶對人肝癌細胞及結(jié)腸癌細胞的抑制作用及機制研究

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【摘要】：惡性腫瘤是一類嚴重威脅人類生命健康的疾病。在各種疾病中,惡性腫瘤的死亡率高居第二位,僅次于心腦血管病。其中肝癌和結(jié)直腸癌分別位列惡性腫瘤發(fā)病率的第三、第四位。臨床上針對此類實體瘤主要以手術(shù)、介入治療及大劑量化療為主,但傳統(tǒng)化療藥物的長期應用使腫瘤細胞耐藥現(xiàn)象越來越普遍,這大大影響了化療藥物的臨床應用。因此,解決化療中的耐藥問題和優(yōu)化化療方案顯得尤為必要。同時腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個多基因、多因素和多階段參與的復雜病理過程,單一療法通常不能取得滿意效果,綜合治療是目前腫瘤治療的主要研究方向。5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)是嘧啶類抗代謝藥,在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為5-氟脫氧尿嘧啶核苷酸(Fd UMP),抑制胸苷酸合成酶(TS)的活性,進而阻斷脫氧尿嘧啶核苷酸(dUMP)轉(zhuǎn)變?yōu)槊撗跣叵汆奏ず塑账?dTMP),干擾DNA合成。5-FU對消化道腫瘤及其他實體瘤有良好療效。其缺點是缺乏對腫瘤細胞的選擇性、毒性大、副作用多、久用易耐藥等。Caspase家族屬于半胱氨酸天冬氨酸-特異性蛋白酶,其家族成員在細胞凋亡過程中起重要作用。其中caspase-3做為細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶,負責整個凋亡級聯(lián)反應過程的最終實施。正常情況下,胞質(zhì)內(nèi)caspase-3以無活性的酶原形式存在(procaspase-3),只有當細胞發(fā)生凋亡時才被激活為有活性的caspase-3。腫瘤細胞的抗凋亡特性,導致細胞內(nèi)procaspase-3含量顯著高于正常細胞,因此,靶向于procaspase-3藥物對腫瘤細胞具有理想的選擇性。半胱氨酸蛋白酶原活化物-1(簡稱PAC-1),在體外能夠迅速活化procaspase-3為caspase-3并引起腫瘤細胞凋亡,并且對多種體內(nèi)皮下移植瘤具有較好的抑制作用。SM-1為PAC-1的結(jié)構(gòu)類似物,具有較好的抗腫瘤活性,有望成為新的靶向procaspase-3的抗腫瘤藥物。本課題旨在研究靶向藥物SM-1與化療藥物5-FU聯(lián)合應用對人肝癌細胞及結(jié)腸癌細胞在體內(nèi)外的協(xié)同抑制作用,并探討其可能的作用機制。從而為兩藥聯(lián)合應用提供依據(jù)。具體研究內(nèi)容如下:第一部分sm-1聯(lián)合氟尿嘧啶對人肝癌細胞及結(jié)腸癌細胞的體外增殖抑制作用目的:考察5-fu聯(lián)合sm-1對人肝癌細胞株hepg2、mhcc97h、lm3,人結(jié)腸癌細胞株hct116、lovo的體外增殖抑制作用。方法:1采用mtt法測定5-fu、sm-1單獨應用及二者聯(lián)合應用時對人肝癌細胞株hepg2、mhcc97h、lm3,人結(jié)腸癌細胞株hct116、lovo的抑制率。2依據(jù)chou-talalay中效原理,以聯(lián)合給藥分析軟件calcusyn2.1計算協(xié)同作用指數(shù)(ci)值,評價聯(lián)合作用效果。結(jié)果:1mtt結(jié)果顯示5-fu、sm-1單藥對人肝癌細胞株hepg2、mhcc97h、lm3的抑制作用具有濃度依賴性。二者聯(lián)合作用72h后,細胞抑制率明顯升高,抑制作用增強。應用calcusyn2.1軟件分析協(xié)同效果,二者在很大范圍內(nèi)具有協(xié)同作用。2mtt結(jié)果顯示5-fu、sm-1單藥對人結(jié)腸癌細胞株hct116、lovo的抑制作用具有濃度依賴性。二者聯(lián)合作用72h后,細胞抑制率明顯升高,抑制作用增強。應用calcusyn2.1軟件分析協(xié)同效果,二者在很大范圍內(nèi)具有協(xié)同作用。結(jié)論:5-fu和sm-1聯(lián)合給藥對人肝癌細胞株hepg2、mhcc97h、lm3,人結(jié)腸癌細胞hct116、lovo的增殖表現(xiàn)出協(xié)同抑制作用。第二部分sm-1聯(lián)合氟尿嘧啶對人肝癌細胞及結(jié)腸癌細胞抑制作用的機制研究目的:考察5-fu聯(lián)合sm-1對人肝癌細胞株hepg2、mhcc97h、lm3,人結(jié)腸癌細胞株hct116、lovo協(xié)同抑制的作用機制。方法:1hochest33342染色觀察聯(lián)合用藥對細胞形態(tài)的影響。2annexinv/pi考察聯(lián)合用藥對細胞凋亡的影響。3jc-1檢測聯(lián)合用藥對線粒體膜電位的影響。4熒光定量pcr檢測凋亡相關(guān)rna:bax、bcl-2、survivin、xiap以及parp。5westernblot檢測凋亡相關(guān)蛋白:caspase-3、bcl-2、bax、survivin及parp。6transwell及劃痕實驗檢測聯(lián)合用藥對細胞侵襲、遷移能力的影響。結(jié)果:1hochest33342染色結(jié)果顯示,5-fu聯(lián)合sm-1組細胞出現(xiàn)明顯的凋亡特征,較單藥處理組及對照組相比,有更多的典型凋亡細胞出現(xiàn)。2annexinv/pi雙染結(jié)果顯示,聯(lián)合處理組細胞凋亡率較單獨給藥組明顯增加。3jc-1檢測結(jié)果顯示,聯(lián)合給藥組細胞表現(xiàn)出綠色熒光增強,紅色熒光減弱,線粒體膜電位較單獨給藥組顯著降低。4熒光定量pcr結(jié)果顯示:與對照組相比,各處理組中bax和parp基因表達顯著升高,其中聯(lián)合給藥組升高最顯著。bcl-2、survivin、xiap基因表達顯著降低,聯(lián)合給藥組降低最明顯。5westernblot結(jié)果顯示:caspase-3蛋白在單藥組及聯(lián)合組的表達顯著高于對照組,且聯(lián)合給藥組表達明顯高于單藥組。各處理組bcl-2及survivin蛋白表達較對照組低,且兩藥聯(lián)合應用后蛋白表達較單藥組明顯降低。各處理組bax、parp蛋白表達較對照組增加,且聯(lián)合給藥組bax及parp蛋白表達也較單藥組明顯增加。6transwell及劃痕實驗顯示聯(lián)合用藥顯著降低肝癌細胞hepg2的侵襲和遷移能力。結(jié)論:5-fu和sm-1聯(lián)合給藥對人肝癌細胞株hepg2、mhcc97h、lm3,人結(jié)腸癌細胞株hct116、lovo的凋亡具有協(xié)同作用。協(xié)同誘導凋亡的機制可能是通過活化caspase-3,上調(diào)bax/bcl-2比例,下調(diào)survivin、xiap來實現(xiàn)的。第三部分sm-1聯(lián)合氟尿嘧啶對人肝癌細胞及結(jié)腸癌細胞抑制作用的體內(nèi)研究目的:建立人肝癌細胞裸鼠原位腫瘤模型和人結(jié)腸癌細胞裸鼠皮下移植瘤模型考察5-fu聯(lián)合sm-1的體內(nèi)抗腫瘤效果。方法:1建立人肝癌細胞hepg2、mhcc97h裸鼠肝原位模型,給藥結(jié)束后頸部脫臼處死動物,解剖取出瘤塊,稱重。通過瘤重反應5-fu、sm-1及二者聯(lián)合應用的體內(nèi)抗腫瘤作用效果。通過觀察裸鼠的行為、活動及體重的變化來評估用藥的安全性。2活體生物發(fā)光成像。建立穩(wěn)定表達pcdh-gfp-luc的lm3-gfp/luc細胞。建立lm3-gfp/luc細胞裸鼠肝原位模型,通過小動物活體成像系統(tǒng)采集腫瘤自發(fā)熒光信號變化趨勢及瘤重來考察5-fu、sm-1及二者聯(lián)合應用的體內(nèi)抗腫瘤作用效果。通過觀察裸鼠的行為、活動及體重的變化來評估用藥的安全性。3建立人結(jié)腸癌細胞hct116、lovo裸鼠皮下移植瘤模型,分組給藥,每三天稱體重、測量腫瘤體積。實驗結(jié)束后頸部脫臼處死動物,解剖取出瘤塊稱重。通過腫瘤體積的變化趨勢及瘤重來比較5-fu、sm-1及二者聯(lián)合應用的體內(nèi)抗腫瘤作用效果。通過觀察裸鼠的行為、活動及體重的變化來評估用藥的安全性。4腫瘤組織經(jīng)石蠟包埋、切片,通過he染色、觀察病理變化。結(jié)果:15-fu、sm-1及二者聯(lián)合用藥均可對hepg2、mhcc97h裸鼠原位移植瘤生長起到抑制作用。其中,聯(lián)合給藥對瘤重的抑制率最高,分別達到70.07%和86.74%。與對照組相比,5-fu、sm-1單獨給藥及二者聯(lián)合給藥均未對荷瘤裸鼠的行為、活動及體重產(chǎn)生明顯影響。25-fu、sm-1及二者聯(lián)合用藥均可對lm3-gfp/luc裸鼠原位移植瘤生長起到抑制作用,其中,5-fu聯(lián)合sm-1給藥對瘤重的抑制率最高,達到75.11%。小動物活體成像系統(tǒng)顯示,聯(lián)合給藥組腫瘤的自發(fā)熒光強度顯著低于對照組(p0.05)。與對照組相比,5-fu、sm-1單獨給藥及二者聯(lián)合給藥均未對荷瘤裸鼠的行為、活動及體重產(chǎn)生明顯影響。35-fu、sm-1及二者聯(lián)合用藥均可對hct116、lovo裸鼠移植瘤生長起到抑制作用,其中,5-fu聯(lián)合sm-1給藥對腫瘤體積及瘤重的抑制率最高,對于hct116模型,瘤體積抑制率達到70.42%,瘤重抑制率為69.14%。對于lovo模型,瘤體積抑制率達到78.07%,瘤重抑制率為73.09%。與對照組相比,5-fu、sm-1單獨給藥及二者聯(lián)合給藥均未對荷瘤裸鼠的行為、活動及體重產(chǎn)生明顯影響。4 HE染色結(jié)果顯示:對照組腫瘤細胞結(jié)構(gòu)完整。5-FU組、SM-1組及聯(lián)合給藥組腫瘤細胞均呈現(xiàn)不同程度的皺縮變圓、核固縮,以聯(lián)合給藥組的腫瘤細胞破壞最嚴重,凋亡最明顯。結(jié)論:5-Fu和SM-1聯(lián)合給藥對人肝癌細胞HepG2、MHCC97H、LM3-GFP/Luc裸鼠原位腫瘤模型及人結(jié)腸癌細胞HCT116、LoVo裸鼠皮下移植瘤模型的生長具有協(xié)同抑制作用。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R96

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