本文關(guān)鍵詞：冠心病血瘀證相關(guān)IncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究

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【摘要】：背景及目的隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,人口老齡化進(jìn)程的加快等,心血管疾病的危險(xiǎn)因素水平持續(xù)增加,冠心病已成為致死率最高的慢性疾病之一。在我國乃至全球,冠心病發(fā)病率和造成的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)日益增加,對(duì)冠心病病理機(jī)制的持續(xù)探討并以此進(jìn)行治療策略的優(yōu)化顯得極為迫切。在現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)理論中,冠心病屬于"胸痹"、"心痛"的范疇,血瘀是臨床上冠心病心絞痛的最主要證候要素。從瘀血角度探討冠心病血瘀證的病理發(fā)生發(fā)展,有助于深層理解冠心病血瘀證。隨著近十年組學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)處理技術(shù)的高速發(fā)展,對(duì)冠心病血瘀證證候本質(zhì)的研究,已進(jìn)入基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)層面。利用基因組學(xué)信息量大、指標(biāo)客觀而層次深、具有網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)性的特點(diǎn),可以從多角度深入挖掘冠心病血瘀證證候本質(zhì)。本研究在既往研究基礎(chǔ)上,通過高通量測(cè)序篩選冠心病血瘀證相關(guān)基因表達(dá)譜,以shRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)驗(yàn)證基因間調(diào)控關(guān)系,構(gòu)建lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò),定位該基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn),從轉(zhuǎn)錄組學(xué)層面對(duì)冠心病血瘀證的病理機(jī)制和證候本質(zhì)進(jìn)行探索,為未來開發(fā)冠心病血淤證生物標(biāo)志物和活血化瘀作用靶點(diǎn)提供客觀科學(xué)依據(jù)。方法1文獻(xiàn)研究近40年對(duì)中醫(yī)證型的相關(guān)研究,從宏觀到微觀,從量表研究到實(shí)驗(yàn)研究,從以疾病、癥狀、組織、細(xì)胞等為主體,目前已逐漸發(fā)展至分子水平、基因水平。檢索中國知網(wǎng)、維普網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)、Pubmed和Web of Science數(shù)據(jù)庫,獲取中醫(yī)證型相關(guān)基因組學(xué)研究(對(duì)具體疾病、證型、干預(yù)手段無限制)。研究范圍包括臨床試驗(yàn)、動(dòng)物及細(xì)胞實(shí)驗(yàn),使用基因芯片、高通量測(cè)序等組學(xué)技術(shù),研究SNP、DNA、mRNA、ncRNA(包括 miRNA、lncRNA、circularRNA)等基因組/轉(zhuǎn)錄組學(xué)指標(biāo)。提取納入研究的出版資料、研究?jī)?nèi)容(包括研究物種、研究疾病、涉及證型、是否干預(yù))、組學(xué)技術(shù)(包括檢測(cè)指標(biāo)、檢測(cè)技術(shù)、使用技術(shù)最大讀數(shù)、差異判斷標(biāo)準(zhǔn)、差異基因個(gè)數(shù)、是否進(jìn)行驗(yàn)證、進(jìn)一步分析方法)以及研究特點(diǎn)進(jìn)行文獻(xiàn)綜述研究,總結(jié)相關(guān)研究趨勢(shì),并為本研究的研究思路與方法提供參考。2實(shí)驗(yàn)研究使用高通量測(cè)序技術(shù),分別檢測(cè)冠心病血淤證、冠心病非血瘀證和正常對(duì)照人群外周血有核細(xì)胞中l(wèi)ncRNA、miRNA和mRNA表達(dá)情況,使用生物信息學(xué)算法篩選出冠心病血瘀證與正常對(duì)照、冠心病血淤證與冠心病非血淤證之間的差異表達(dá)基因,并使用關(guān)聯(lián)分析,獲取冠心病血瘀證相關(guān)的lncRNA、miRNA、mRNA表達(dá)譜。對(duì)獲得的差異基因進(jìn)行聚類分析、主成分分析、GO和KEGG功能通路分析。通過starBase在線靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫和基因測(cè)序表達(dá)量相關(guān)分析,獲取基因間調(diào)控關(guān)系,構(gòu)建冠心病血瘀證相關(guān)lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在另一匹配隊(duì)列中對(duì)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。使用慢病毒介導(dǎo)的shRNA轉(zhuǎn)染技術(shù),對(duì)冠心病血瘀證相關(guān)lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵基因進(jìn)行干擾,檢測(cè)其上下游調(diào)控節(jié)點(diǎn)表達(dá)水平,對(duì)lncRNA、miRNA、mRNA之間的調(diào)控作用及該基因網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行驗(yàn)證,從轉(zhuǎn)錄組調(diào)控層面對(duì)冠心病血瘀證的證型本質(zhì)和病理機(jī)制進(jìn)行探索。結(jié)果1中醫(yī)證型相關(guān)基因組學(xué)研究分析通過檢索獲得30篇中醫(yī)證型相關(guān)基因組學(xué)研究文獻(xiàn),其中中文期刊論文17篇,英文期刊論文13篇,最早發(fā)表年份為2005年,最近發(fā)表年份為2016年。對(duì)納入的30項(xiàng)研究進(jìn)行文獻(xiàn)綜述研究,發(fā)現(xiàn)中醫(yī)證型相關(guān)基因組學(xué)研究歷經(jīng)十余年,在13種疾病/狀態(tài)和11種證型中開展,通過基因芯片或高通量測(cè)序技術(shù),從DNA/cDNA、mRNA、miRNA、lncRNA和SNP等多個(gè)角度對(duì)中醫(yī)證型物質(zhì)基礎(chǔ)、基因表型進(jìn)行了探索。研究最多疾病為冠心病、腦卒中、乙型肝炎、糖尿病以及衰老;研究最多證型為血瘀證與腎陽虛證(各8項(xiàng)),其次為濕濁中阻證與肝郁脾虛證(各4項(xiàng))。研究最多指標(biāo)為mRNA,近年來miRNA或lncRNA聯(lián)合mRNA進(jìn)行的研究日益增多。從研究方法與結(jié)果來說,中醫(yī)證型相關(guān)基因組學(xué)研究目前仍處于發(fā)展階段,如缺乏統(tǒng)一、公認(rèn)的證型診斷標(biāo)準(zhǔn)或證型造模方法,結(jié)果分析仍停留在表層的差異基因篩選,未能進(jìn)行更深層次的功能分析,未對(duì)研究結(jié)果進(jìn)行PCR驗(yàn)證等。中醫(yī)證型相關(guān)基因組學(xué)研究在取得一定成果的同時(shí),需要在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)方法、研究規(guī)劃方面提高其合理性、嚴(yán)謹(jǐn)性和科學(xué)性,并對(duì)研究結(jié)果進(jìn)行深化研究,深入探索差異基因的生物學(xué)功能以及作用途徑,為中醫(yī)證型客觀化、標(biāo)準(zhǔn)化、探索其物質(zhì)基礎(chǔ)提供科學(xué)證據(jù)與研究新思路。2冠心病血瘀證丨ncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究使用高通量測(cè)序技術(shù)及生物信息學(xué)分析方法,對(duì)冠心病血瘀證、冠心病非血瘀證和正常對(duì)照進(jìn)行兩兩比較和交聯(lián)比較,最終獲得39個(gè)lncRNA(3個(gè)上調(diào),36個(gè)下調(diào)),229個(gè)miRNA(138個(gè)上調(diào),91個(gè)下調(diào))和221個(gè)mRNA(105個(gè)上調(diào),116個(gè)下調(diào))在冠心病血瘀證中差異表達(dá)。分層聚類分析和主成分分析顯示冠心病血淤證與正常對(duì)照、冠心病非血淤證與正常對(duì)照之間在lncRNA、miRNA和mRNA均有較明顯的差異表達(dá)基因譜,lncRNA、miRNA和mRNA可將該3組樣本區(qū)分,各個(gè)樣本被正確歸類。通過對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行功能與通路分析,發(fā)現(xiàn)冠心病血瘀證差異表達(dá)基因主要與免疫和炎癥相關(guān),如免疫反應(yīng)的激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、γγ-干擾素介導(dǎo)的信號(hào)通路、T細(xì)胞共刺激、白細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)、Toll樣受體信號(hào)通路等。利用starBase和相關(guān)分析獲得的基因間互作關(guān)系顯示,冠心病血瘀證相關(guān)差異基因間共有76個(gè)調(diào)控關(guān)系,涉及9個(gè)lncRNA(均為下調(diào))、31個(gè)mRNA(11個(gè)上調(diào),20個(gè)下調(diào))和24個(gè)miRNA(14個(gè)上調(diào),10個(gè)下調(diào))。根據(jù)此調(diào)控關(guān)系集構(gòu)建冠心病血瘀證相關(guān)lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò),經(jīng)過網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龊晚f恩分析,3個(gè)lncRNA(CTA-384D8.35、CTB-114C7.4 和 RP11-567M16.6)和 1 個(gè) miRNA(hsa-miR-3158-3p)被認(rèn)為是網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。相同人群隊(duì)列的qRT-PCR驗(yàn)證支持上述結(jié)果。挑選基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)(CTA-384D8.35和CTB-114C7.4)和miRNA(miR-3196和miR-3656)進(jìn)行基因干擾,檢測(cè)受調(diào)控的mRNA(NR4A1、EGR1、IER2和IER3),對(duì)冠心病血瘀證基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示該網(wǎng)絡(luò)中主要存在以下調(diào)控方式:①LncRNA上調(diào)mRNA的表達(dá);②LncRNA下調(diào)部分mRNA的表達(dá)水平;③miRNA抑制mRNA的表達(dá);④miRNA亦可促進(jìn)mRNA的表達(dá);⑤lncRNA和miRNA之間存在雙向調(diào)控模式;⑥lncRNA-miRNA-mRNA的共調(diào)控模式。結(jié)論冠心病血瘀證存在lncRNA、miRNA、mRNA差異表達(dá)基因譜,相關(guān)基因功能與涉及通路多與免疫和炎癥反應(yīng)相關(guān)。上述差異表達(dá)基因間存在相互調(diào)控關(guān)系,并可依此構(gòu)建冠心病血瘀證相關(guān)lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。RNAi研究證實(shí)了 lncRNA、miRNA、mRNA之間的多向、交聯(lián)、復(fù)雜調(diào)控模式,驗(yàn)證了該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的真實(shí)性。冠心病血瘀證相關(guān)lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其中調(diào)控關(guān)系的探索研究,為冠心病血瘀證的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供一定的科學(xué)基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R259

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本文編號(hào)：1305305