本文關(guān)鍵詞：納米超聲微泡介導(dǎo)NGF基因治療大鼠急性不完全脊髓損傷

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【摘要】：脊髓損傷(Spinal cord injury SCI)是一種可逆性差、致殘率高的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病,其損傷機(jī)制十分復(fù)雜,目前仍是一大醫(yī)學(xué)難題。脊髓損傷的基因治療目前尚處于探索階段,雖然基因治療脊髓損傷在體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都取得了重大進(jìn)展,但仍有許多問題亟待解決,如外源性基因的安全性、轉(zhuǎn)染后表達(dá)及其持續(xù)性、免疫排斥反應(yīng)、倫理性問題等。雖然還沒有一種基因治療方法可應(yīng)用于臨床治療脊髓損傷,但利用目的基因在靶細(xì)胞中的表達(dá)及其相關(guān)特性來保護(hù)神經(jīng)元、促進(jìn)神經(jīng)元再生,以及抑制局部膠質(zhì)瘢痕增生等,最終達(dá)到脊髓神經(jīng)功能恢復(fù),是目前治療脊髓損傷的研究方向。近年來,超聲靶向微泡破裂(UTMD)技術(shù)成為基因轉(zhuǎn)染領(lǐng)域研究的熱點(diǎn),其技術(shù)原理主要是體外目的基因或藥物與超聲微泡結(jié)合,然后將載基因或藥物超聲微泡導(dǎo)入體內(nèi),再進(jìn)行體外超聲輻照,利用超聲微泡在超聲輻照下的產(chǎn)生的空化效應(yīng),在細(xì)胞膜上形成可逆孔隙,從而使目的基因或藥物更容易進(jìn)入細(xì)胞達(dá)到靶向治療目的。本課題以神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)基因作為目的基因,在優(yōu)化超聲微泡制備工藝的基礎(chǔ)上,制備出一種高效的載NGF基因的PLGA納米超聲微泡,然后通過超聲靶向微泡破裂技術(shù)(UTMD)介導(dǎo)NGF基因治療大鼠急性脊髓損傷,最后采用HE染色、尼氏染色、免疫熒光技術(shù)、Westernblot、q RT-PCR、神經(jīng)元凋亡檢測(cè)以及神經(jīng)功能恢復(fù)評(píng)估等方法觀察NGF基因在損傷脊髓組織中的表達(dá)情況,神經(jīng)元再生情況及大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)情況,初步評(píng)估NGF/PLGA納米微泡治療急性不完全脊髓損傷的療效,以期為治療脊髓損傷提供一種新的思路和治療方法。第一部分載NGF基因PLGA納米超聲微泡的制備和性能檢測(cè)目的制備一種包載神經(jīng)生長(zhǎng)因子基因(NGF)的聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)納米超聲微泡,并研究NGF/PLGA納米超聲微泡的理化性質(zhì)。方法采用雙乳化法制備NGF/PLGA納米超聲微泡,觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu),檢測(cè)其粒徑、電位及分散系數(shù),測(cè)定其基因包封率及體外超聲輻照下基因釋放情況,并在不同濃度梯度及時(shí)間梯度下觀察其超聲顯像效果。結(jié)果NGF/PLGA納米超聲微泡在光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡觀察下呈球形,形態(tài)均勻,大小較一致,分散度良好。NGF/PLGA納米超聲微泡的平均粒徑為215.3±55.29 nm,Zeta電位為-11.3±5.65 m V,分散系數(shù)為0.027。紫外分光光度法檢測(cè)其基因包封率為34.33±2.02%;體外超聲輻照后12小時(shí)GF/PLGA納米超聲微泡基因累積釋放率達(dá)到52.7%,48小時(shí)后基因累積釋放率達(dá)到62.6%。體外超聲顯像結(jié)果顯示NGF/PLGA納米超聲微泡性能穩(wěn)定,其超聲回聲強(qiáng)度隨著濃度的增加而增強(qiáng),在48小時(shí)內(nèi)其平均超聲回聲強(qiáng)度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)所準(zhǔn)備的載NGF基因的納米超聲微泡形態(tài)均勻、大小一致,分散度良好,包載基因效率高,且具有較好的顯像性能,理化性質(zhì)穩(wěn)定,是一種理想的基因載體。第二部分超聲靶向破裂技術(shù)介導(dǎo)NGF基因治療大鼠急性不完全脊髓損傷目的探討超聲靶向破裂技術(shù)介導(dǎo)NGF/PLGA納米超聲微泡治療鼠急性不完全脊髓損傷可行性及效果。方法構(gòu)建大鼠急性不完全脊髓損傷模型(Allen法),148只成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為四組:A組:生理鹽水(NS)組;B組:NGF+空白微泡(NGF+NBs)組;C組:NGF+超聲(NGF+US)組;D組:NGF/PLGA NBs+超聲(NGF/PLGA NBs+US)組,每組37只。經(jīng)尾靜脈注射藥物后再經(jīng)相關(guān)處理后,在不同時(shí)間點(diǎn)采用組織學(xué)蘇木精和伊紅染色(HE)觀察脊髓損傷后的病理變化;尼氏染色法(Nissl)觀察神經(jīng)元存活及再生情況;末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的d UTP缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)染色法檢測(cè)神經(jīng)元凋亡情況;采用RT-PCR和Western blotting法檢測(cè)NGF基因和蛋白的表達(dá)情況;通過倒置熒光顯微鏡觀察偶聯(lián)綠色熒光蛋白的表達(dá)情況;最終采用Basso,Beattie,and Bresnahan(BBB)法評(píng)估大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)情況。結(jié)果與其他治療組相比,NGF/PLGA NBs+US治療組能明顯增加NGF基因的表達(dá),減輕脊髓組織損傷,減少神經(jīng)元的丟失,能抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡,最終促進(jìn)脊髓損傷后大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)。結(jié)論超聲靶向破裂技術(shù)介導(dǎo)NGF/PLGA納米超聲微泡能有效地將NGF基因轉(zhuǎn)染入損傷脊髓組織,并能促進(jìn)脊髓損傷的修復(fù)。以NGF/PLGA NBs為基礎(chǔ)的超聲輻照聯(lián)合基因治療在治療脊髓損傷及其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面有廣闊的應(yīng)用前景,為脊髓損傷的治療提供了一種新型、安全的方法。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R651.2

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本文編號(hào)：1304231