本文關鍵詞：黏蛋白O-型糖鏈的生物學意義及Ascl2自調控的研究

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【摘要】：背景目的腸粘膜屏障由粘液和粘液下上皮細胞所組成,由上皮細胞合成或分泌的黏蛋白主要由O-型糖鏈組成。因此黏蛋白分子的功能與其上的O-型糖鏈密切相關。同時有文獻報道,腸道黏蛋白O-型糖鏈可作為某些細菌的粘附位點;黏蛋白O-型糖鏈與一些腫瘤的侵襲轉移及預后相關。但是結腸上皮細胞中黏蛋白O-型糖基化修飾與腸道致病菌(EPEC和EHEC O157:H7)之間的相互作用,以及刺激信號轉導進而調控腫瘤轉移的具體機制仍不完全清楚。O-型糖鏈的合成始于GalNAc或甘露糖轉移到多肽絲氨酸,蘇氨酸和脯氨酸殘基上,首先形成Tn(GalNAca1-Ser/Thr)抗原,糖鏈的延伸是在Tn抗原的基礎上,由各種糖基轉移酶催化完成,其核心結構主要有八種(Core1-8)。因此,我們通過benzyl-α-GalNAc抑制O-型糖鏈合成來探討O-型糖鏈對腸道致病菌粘附和侵襲腸上皮細胞的影響;通過干擾Core 2 O-型糖鏈合成來探討Core 2 O-型糖鏈對細菌粘附和侵襲腸上皮細胞的影響;通過再表達Core 3合酶來探討Core 3 O-型糖鏈調節(jié)結腸上皮細胞EMT-MET可塑性的分子機制。腸上皮細胞的更新與分化是腸上皮粘膜屏障的主要機制之一,Ascl2所調節(jié)的腸隱窩干細胞更新是維持腸上皮粘膜的重要來源。文獻報道,在Lgr5+的隱窩干細胞存在自轉錄激活現(xiàn)象,本研究探討Ascl2在結腸癌前體細胞內是否存在該現(xiàn)象及其生物學意義。因此,我們通過流式細胞儀分選出CD133-CD44-和CD133+CD44+結腸癌細胞,通過不同濃度Wnt/R-spondin1刺激來探討Ascl2自調控的分子機制。方法1.黏蛋白Core 2 O-型糖鏈調節(jié)細菌粘附和侵襲腸上皮細胞的研究1.1 HT-29-Gal細胞模型的建立。1.2 benzyl-α-GalNAc抑制結腸上皮細胞O-型糖鏈合成,得到HT-29-OBN和HT-29-Gal-OBN細胞。1.3通過lectin(Con A,GSL-II,MAA,PNA,DBA,UEA-I)染色,明確建立的細胞模型是否發(fā)生糖基化改變。1.4 EPEC或EHEC O157:H7粘附和侵襲結腸上皮細胞通過直接染色、平板克隆計數(shù)、GFP標記細菌觀察。1.5通過干擾Core 2 O-型糖鏈的合成,觀察O-型糖鏈對EPEC或EHEC O157:H7粘附或侵襲結腸上皮的影響。1.6在EPEC或EHEC O157:H7感染下,通過TEER測定和免疫熒光染色緊密連接蛋白,明確細菌對細胞屏障的影響。2.黏蛋白Core 3 O-型糖鏈調節(jié)結腸癌MET的研究2.1通過分析TCGA數(shù)據庫和GEO數(shù)據庫,明確Core 3合酶在腫瘤組織與正常組織表達差異,以及臨床意義(淋巴轉移、遠處轉移和預后)。2.2 Core 3合酶再表達細胞株的構建;并檢測Core 3合酶再表達后,細胞增殖、遷移、侵襲、成瘤能力的改變;以及EMT相關標志物的改變。2.3 Core 3合酶再表達是否影響O-型糖鏈的結構、MUC1糖基化、MUC1-C核轉位及p53和mi R-200c的表達。2.4通過構建p53和mi R-200c啟動子的螢光素酶報告質粒分別轉染對照細胞和Core 3合酶再表達細胞,明確Core 3 O-型糖鏈對p53和mi R-200c基因轉錄的影響。并通過Ch IP實驗證實MUC1-C與p53啟動子,p53與mi R-200c啟動子存在直接結合。2.5通過MUC1-C核轉位抑制劑(GO201)、干擾MUC1或p53、mi R-200c抑制劑,進一步明確Core 3 O-型糖鏈是通過MUC1-C/p53/mi R-200c軸調節(jié)結腸上皮細胞EMT-MET可塑性。3.Ascl2自調控的研究3.1通過PCR和Western blot驗證外源性Ascl2是否激活內源性Ascl2的表達。3.2通過Ch IP和雙熒光素酶實驗明確Ascl2是否通過直接自調控環(huán)激活內源Ascl2的表達。包括Ascl2結合到自身啟動子,并轉錄激活Ascl2基因的表達。3.3流式細胞儀分選出結腸上皮細胞中CD133-CD44-CRC和CD133+CD44+CRC細胞群。3.4不同濃度R-spondin1/Wnt刺激CD133-CD44-CRC和CD133+CD44+CRC細胞群,并通過PCR和Western blot檢測Ascl2的表達,通過雙熒光素酶實驗檢測Ascl2熒光素酶活性變化。結果1.黏蛋白Core 2 O-型糖鏈調節(jié)細菌粘附和侵襲腸上皮細胞的研究1.1 benzyl-α-GalNAc處理HT-29細胞及分化的HT-29-Gal細胞導致O-型糖基化的改變。1.2 lectin組織化學染色證實在HT-29-Gal-OBN和C2Gn T2-sh2/HT-29細胞中PNA(特異性識別Galβ1,3GalNAc)的染色明顯強于其對照細胞。1.3抑制結腸上皮細胞O-型糖鏈的合成將導致EPEC和EHEC O157:H7粘附減少;抑制結腸上皮細胞Core 2 O-型糖鏈合成將導致EPEC和EHEC O157:H7粘附明顯減少。1.4通過共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)GFP標記的EPEC和EHEC O157:H7侵襲入HT-29及其分化細胞中;侵襲入促分化HT-29細胞(HT-29-Gal)中的EPEC明顯少于其對照HT-29細胞(P0.01);抑制HT-29細胞或HT-29-Gal細胞中O-型糖鏈的合成導致細菌侵襲易感(P0.05和P0.01);EPEC和EHEC O157:H7侵襲入Core 2 O-型糖鏈缺失的HT-29細胞中的細菌數(shù)較對照細胞明顯增加(P0.05)。1.5抑制結腸上皮細胞O-型糖鏈的合成導致MUC2表達明顯減少,但抑制結腸上皮細胞Core 2 O-型糖鏈的合成對MUC2的表達沒有明顯影響;同時在EPEC或EHEC O157:H7感染下,occludin蛋白在細胞膜的分布呈現(xiàn)不連續(xù),顆粒樣聚集。2.黏蛋白Core 3 O-型糖鏈調節(jié)結腸癌MET的研究2.1 Core 3合酶表達下調導致結直腸癌病人預后差,并與淋巴結轉移和遠處轉移密切相關。2.2 Core 3合酶再表達抑制結腸上皮細胞增殖、遷移、侵襲和成瘤能力。2.3黏蛋白Core 3 O-型糖鏈合成于結腸癌細胞膜表面的MUC1-N端,可通過修飾MUC1-N端,進而導致MUC1-C端核轉位抑制,并啟動p53基因的轉錄和激活p53調控的mi R-200c的表達,導致細胞出現(xiàn)間質向上皮轉化(MET)過程的發(fā)生。2.4通過si RNA和mi R-200c抑制劑抑制MUC1,p53或mi R-200c的表達,抑制MUC1的表達導致EMT的進一步的加強,抑制p53或mi R-200c逆轉Core 3合酶過表達結腸癌細胞株的MET進程。2.5在結腸癌組織樣本中,Core 3合酶的m RNA表達與p53和mi R-200c的表達呈顯著正相關。3.Ascl2自調控的研究3.1外源Ascl2可通過直接自調控環(huán)激活內源Ascl2的表達。包括Ascl2結合到自身啟動子,并轉錄激活Ascl2的表達。3.2在結腸癌組織中,Ascl2表達量明顯高于其對應的癌旁組織,且結合自身啟動子的量也明顯高于其對應的癌旁組織。3.3 Ascl2自調控主要發(fā)生在CD133+CD44+CRC細胞群。在CD133+CD44+CRC細胞群中,R-spondin1/Wnt呈劑量依賴性激活Ascl2表達。該現(xiàn)象不出現(xiàn)在CD133-CD44-CRC細胞群。3.4 R-spondin1/Wnt處理的CD133+CD44+和CRC CD133-CD44-CRC細胞“干性”維持模式不同。R-spondin1/Wnt導致CD133+CD44+CRC細胞劑量依賴性的干性維持。結論1.黏蛋白Core 2 O-型糖鏈調節(jié)腸道致病菌(EPEC和EHEC O157:H7)粘附結腸上皮細胞。2.黏蛋白Core 2 O-型糖鏈調節(jié)腸道致病菌(EPEC和EHEC O157:H7)侵襲結腸上皮細胞。3.黏蛋白Core 3 O-型糖鏈的恢復觸發(fā)結腸上皮細胞MUC1/p53/mi R-200c依賴的上皮特性。4.R-Spondin1/Wnt增強的Ascl2自調控維持結腸癌前體細胞的自更新。
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R730.2

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本文編號：1304082