本文關(guān)鍵詞：黏蛋白O-型糖鏈的生物學(xué)意義及Ascl2自調(diào)控的研究

  更多相關(guān)文章： O-型糖鏈 benzyl-α-GalNAc MET Ascl2 自調(diào)控

【摘要】：背景目的腸粘膜屏障由粘液和粘液下上皮細(xì)胞所組成,由上皮細(xì)胞合成或分泌的黏蛋白主要由O-型糖鏈組成。因此黏蛋白分子的功能與其上的O-型糖鏈密切相關(guān)。同時有文獻(xiàn)報(bào)道,腸道黏蛋白O-型糖鏈可作為某些細(xì)菌的粘附位點(diǎn);黏蛋白O-型糖鏈與一些腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)。但是結(jié)腸上皮細(xì)胞中黏蛋白O-型糖基化修飾與腸道致病菌(EPEC和EHEC O157:H7)之間的相互作用,以及刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)而調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制仍不完全清楚。O-型糖鏈的合成始于GalNAc或甘露糖轉(zhuǎn)移到多肽絲氨酸,蘇氨酸和脯氨酸殘基上,首先形成Tn(GalNAca1-Ser/Thr)抗原,糖鏈的延伸是在Tn抗原的基礎(chǔ)上,由各種糖基轉(zhuǎn)移酶催化完成,其核心結(jié)構(gòu)主要有八種(Core1-8)。因此,我們通過benzyl-α-GalNAc抑制O-型糖鏈合成來探討O-型糖鏈對腸道致病菌粘附和侵襲腸上皮細(xì)胞的影響;通過干擾Core 2 O-型糖鏈合成來探討Core 2 O-型糖鏈對細(xì)菌粘附和侵襲腸上皮細(xì)胞的影響;通過再表達(dá)Core 3合酶來探討Core 3 O-型糖鏈調(diào)節(jié)結(jié)腸上皮細(xì)胞EMT-MET可塑性的分子機(jī)制。腸上皮細(xì)胞的更新與分化是腸上皮粘膜屏障的主要機(jī)制之一,Ascl2所調(diào)節(jié)的腸隱窩干細(xì)胞更新是維持腸上皮粘膜的重要來源。文獻(xiàn)報(bào)道,在Lgr5+的隱窩干細(xì)胞存在自轉(zhuǎn)錄激活現(xiàn)象,本研究探討Ascl2在結(jié)腸癌前體細(xì)胞內(nèi)是否存在該現(xiàn)象及其生物學(xué)意義。因此,我們通過流式細(xì)胞儀分選出CD133-CD44-和CD133+CD44+結(jié)腸癌細(xì)胞,通過不同濃度Wnt/R-spondin1刺激來探討Ascl2自調(diào)控的分子機(jī)制。方法1.黏蛋白Core 2 O-型糖鏈調(diào)節(jié)細(xì)菌粘附和侵襲腸上皮細(xì)胞的研究1.1 HT-29-Gal細(xì)胞模型的建立。1.2 benzyl-α-GalNAc抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞O-型糖鏈合成,得到HT-29-OBN和HT-29-Gal-OBN細(xì)胞。1.3通過lectin(Con A,GSL-II,MAA,PNA,DBA,UEA-I)染色,明確建立的細(xì)胞模型是否發(fā)生糖基化改變。1.4 EPEC或EHEC O157:H7粘附和侵襲結(jié)腸上皮細(xì)胞通過直接染色、平板克隆計(jì)數(shù)、GFP標(biāo)記細(xì)菌觀察。1.5通過干擾Core 2 O-型糖鏈的合成,觀察O-型糖鏈對EPEC或EHEC O157:H7粘附或侵襲結(jié)腸上皮的影響。1.6在EPEC或EHEC O157:H7感染下,通過TEER測定和免疫熒光染色緊密連接蛋白,明確細(xì)菌對細(xì)胞屏障的影響。2.黏蛋白Core 3 O-型糖鏈調(diào)節(jié)結(jié)腸癌MET的研究2.1通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫和GEO數(shù)據(jù)庫,明確Core 3合酶在腫瘤組織與正常組織表達(dá)差異,以及臨床意義(淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和預(yù)后)。2.2 Core 3合酶再表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建;并檢測Core 3合酶再表達(dá)后,細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、成瘤能力的改變;以及EMT相關(guān)標(biāo)志物的改變。2.3 Core 3合酶再表達(dá)是否影響O-型糖鏈的結(jié)構(gòu)、MUC1糖基化、MUC1-C核轉(zhuǎn)位及p53和mi R-200c的表達(dá)。2.4通過構(gòu)建p53和mi R-200c啟動子的螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染對照細(xì)胞和Core 3合酶再表達(dá)細(xì)胞,明確Core 3 O-型糖鏈對p53和mi R-200c基因轉(zhuǎn)錄的影響。并通過Ch IP實(shí)驗(yàn)證實(shí)MUC1-C與p53啟動子,p53與mi R-200c啟動子存在直接結(jié)合。2.5通過MUC1-C核轉(zhuǎn)位抑制劑(GO201)、干擾MUC1或p53、mi R-200c抑制劑,進(jìn)一步明確Core 3 O-型糖鏈?zhǔn)峭ㄟ^MUC1-C/p53/mi R-200c軸調(diào)節(jié)結(jié)腸上皮細(xì)胞EMT-MET可塑性。3.Ascl2自調(diào)控的研究3.1通過PCR和Western blot驗(yàn)證外源性Ascl2是否激活內(nèi)源性Ascl2的表達(dá)。3.2通過Ch IP和雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)明確Ascl2是否通過直接自調(diào)控環(huán)激活內(nèi)源Ascl2的表達(dá)。包括Ascl2結(jié)合到自身啟動子,并轉(zhuǎn)錄激活A(yù)scl2基因的表達(dá)。3.3流式細(xì)胞儀分選出結(jié)腸上皮細(xì)胞中CD133-CD44-CRC和CD133+CD44+CRC細(xì)胞群。3.4不同濃度R-spondin1/Wnt刺激CD133-CD44-CRC和CD133+CD44+CRC細(xì)胞群,并通過PCR和Western blot檢測Ascl2的表達(dá),通過雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測Ascl2熒光素酶活性變化。結(jié)果1.黏蛋白Core 2 O-型糖鏈調(diào)節(jié)細(xì)菌粘附和侵襲腸上皮細(xì)胞的研究1.1 benzyl-α-GalNAc處理HT-29細(xì)胞及分化的HT-29-Gal細(xì)胞導(dǎo)致O-型糖基化的改變。1.2 lectin組織化學(xué)染色證實(shí)在HT-29-Gal-OBN和C2Gn T2-sh2/HT-29細(xì)胞中PNA(特異性識別Galβ1,3GalNAc)的染色明顯強(qiáng)于其對照細(xì)胞。1.3抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞O-型糖鏈的合成將導(dǎo)致EPEC和EHEC O157:H7粘附減少;抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞Core 2 O-型糖鏈合成將導(dǎo)致EPEC和EHEC O157:H7粘附明顯減少。1.4通過共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)GFP標(biāo)記的EPEC和EHEC O157:H7侵襲入HT-29及其分化細(xì)胞中;侵襲入促分化HT-29細(xì)胞(HT-29-Gal)中的EPEC明顯少于其對照HT-29細(xì)胞(P0.01);抑制HT-29細(xì)胞或HT-29-Gal細(xì)胞中O-型糖鏈的合成導(dǎo)致細(xì)菌侵襲易感(P0.05和P0.01);EPEC和EHEC O157:H7侵襲入Core 2 O-型糖鏈缺失的HT-29細(xì)胞中的細(xì)菌數(shù)較對照細(xì)胞明顯增加(P0.05)。1.5抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞O-型糖鏈的合成導(dǎo)致MUC2表達(dá)明顯減少,但抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞Core 2 O-型糖鏈的合成對MUC2的表達(dá)沒有明顯影響;同時在EPEC或EHEC O157:H7感染下,occludin蛋白在細(xì)胞膜的分布呈現(xiàn)不連續(xù),顆粒樣聚集。2.黏蛋白Core 3 O-型糖鏈調(diào)節(jié)結(jié)腸癌MET的研究2.1 Core 3合酶表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致結(jié)直腸癌病人預(yù)后差,并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。2.2 Core 3合酶再表達(dá)抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和成瘤能力。2.3黏蛋白Core 3 O-型糖鏈合成于結(jié)腸癌細(xì)胞膜表面的MUC1-N端,可通過修飾MUC1-N端,進(jìn)而導(dǎo)致MUC1-C端核轉(zhuǎn)位抑制,并啟動p53基因的轉(zhuǎn)錄和激活p53調(diào)控的mi R-200c的表達(dá),導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)間質(zhì)向上皮轉(zhuǎn)化(MET)過程的發(fā)生。2.4通過si RNA和mi R-200c抑制劑抑制MUC1,p53或mi R-200c的表達(dá),抑制MUC1的表達(dá)導(dǎo)致EMT的進(jìn)一步的加強(qiáng),抑制p53或mi R-200c逆轉(zhuǎn)Core 3合酶過表達(dá)結(jié)腸癌細(xì)胞株的MET進(jìn)程。2.5在結(jié)腸癌組織樣本中,Core 3合酶的m RNA表達(dá)與p53和mi R-200c的表達(dá)呈顯著正相關(guān)。3.Ascl2自調(diào)控的研究3.1外源Ascl2可通過直接自調(diào)控環(huán)激活內(nèi)源Ascl2的表達(dá)。包括Ascl2結(jié)合到自身啟動子,并轉(zhuǎn)錄激活A(yù)scl2的表達(dá)。3.2在結(jié)腸癌組織中,Ascl2表達(dá)量明顯高于其對應(yīng)的癌旁組織,且結(jié)合自身啟動子的量也明顯高于其對應(yīng)的癌旁組織。3.3 Ascl2自調(diào)控主要發(fā)生在CD133+CD44+CRC細(xì)胞群。在CD133+CD44+CRC細(xì)胞群中,R-spondin1/Wnt呈劑量依賴性激活A(yù)scl2表達(dá)。該現(xiàn)象不出現(xiàn)在CD133-CD44-CRC細(xì)胞群。3.4 R-spondin1/Wnt處理的CD133+CD44+和CRC CD133-CD44-CRC細(xì)胞“干性”維持模式不同。R-spondin1/Wnt導(dǎo)致CD133+CD44+CRC細(xì)胞劑量依賴性的干性維持。結(jié)論1.黏蛋白Core 2 O-型糖鏈調(diào)節(jié)腸道致病菌(EPEC和EHEC O157:H7)粘附結(jié)腸上皮細(xì)胞。2.黏蛋白Core 2 O-型糖鏈調(diào)節(jié)腸道致病菌(EPEC和EHEC O157:H7)侵襲結(jié)腸上皮細(xì)胞。3.黏蛋白Core 3 O-型糖鏈的恢復(fù)觸發(fā)結(jié)腸上皮細(xì)胞MUC1/p53/mi R-200c依賴的上皮特性。4.R-Spondin1/Wnt增強(qiáng)的Ascl2自調(diào)控維持結(jié)腸癌前體細(xì)胞的自更新。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R730.2

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 Aso N. ,Tamura A. ,Nasu M. ,騰增輝;特發(fā)性擴(kuò)張型心肌病患者循環(huán)黏蛋白-C水平[J];世界核心醫(yī)學(xué)期刊文摘(心臟病學(xué)分冊);2005年04期

2 王峻;;中醫(yī)之“痰”與黏蛋白[J];中華中醫(yī)藥學(xué)刊;2011年07期

3 徐曉艷,周向東;中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶與黏蛋白[J];中國藥物與臨床;2004年10期

4 劉小青;王前;任宏軒;;黏蛋白1結(jié)構(gòu)及功能研究現(xiàn)狀[J];臨床薈萃;2008年24期

5 萬云鵬;關(guān)鍵;;黏蛋白在慢性阻塞性肺疾病大鼠肺組織中的研究[J];中華實(shí)用診斷與治療雜志;2010年02期

6 江德華;朱理珩;劉淑嫻;;血清醣蛋白、黏蛋白測定對中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的診斷價值[J];天津醫(yī)藥雜志;1965年04期

7 宋敏;孫旭東;周蓉蓉;李哲夫;;黏蛋白在膽石病中作用的研究進(jìn)展[J];齊魯醫(yī)學(xué)雜志;2010年03期

8 劉詩蘭;尤列·皮爾曼;維克多·科羅索夫;周向東;;節(jié)律性壓力波對家犬氣道黏蛋白分泌平衡的影響及其機(jī)制[J];中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2013年07期

9 黃勇;錢桂生;;氣道黏蛋白唾液酸化的研究進(jìn)展[J];中華內(nèi)科雜志;2007年04期

10 李琪;周向東;;氣道慢性炎癥中黏蛋白5AC基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)[J];國際內(nèi)科學(xué)雜志;2007年01期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前8條

1 葉鈞;黏蛋白O-型糖鏈的生物學(xué)意義及Ascl2自調(diào)控的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2017年

2 王朝鳳;蛋白質(zhì)糖鏈結(jié)構(gòu)色譜質(zhì)譜分析新方法研究[D];復(fù)旦大學(xué);2012年

3 張興旺;卵巢癌轉(zhuǎn)移相關(guān)N-糖鏈的發(fā)現(xiàn)及其在轉(zhuǎn)移中的功能研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

4 譚增琦;平分型N-糖鏈在乳腺癌細(xì)胞及臨床樣本中的分子調(diào)控及生物學(xué)功能研究[D];江南大學(xué);2017年

5 魏曉龍;YAP1/KLF5轉(zhuǎn)錄激活A(yù)scl2調(diào)控結(jié)腸癌CSCs自更新的分子機(jī)制[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2017年

6 劉俠;肝細(xì)胞癌N-糖鏈的結(jié)構(gòu)改變及其機(jī)制研究[D];哈爾濱工業(yè)大學(xué);2013年

7 王培培;動物組織中微量糖鏈結(jié)構(gòu)分析方法的建立及應(yīng)用[D];中國海洋大學(xué);2012年

8 楊剛龍;肝細(xì)胞癌患者血清糖蛋白質(zhì)組及其糖鏈結(jié)構(gòu)研究[D];西北大學(xué);2013年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 丁麗娟;黏蛋白在良、惡性子宮頸病變中的表達(dá)及其臨床意義[D];揚(yáng)州大學(xué);2015年

2 陳璇;豬小腸黏膜肝素加工廢棄物中黏蛋白的提取分離、結(jié)構(gòu)表征及免疫活性評價[D];中國海洋大學(xué);2015年

3 張雙美;細(xì)菌脂多糖誘導(dǎo)的人氣道上皮細(xì)胞黏蛋白和PTEN的表達(dá)及其意義[D];浙江大學(xué);2007年

4 張曼麗;基于質(zhì)譜的糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)解析策略研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2016年

5 秦鑫敏;慢性乙型、丙型肝炎患者血清糖蛋白糖鏈譜的研究[D];西北大學(xué);2016年

6 付新樂;妊娠期婦女唾液中糖蛋白糖鏈變化及其與流感病毒易感關(guān)聯(lián)性研究[D];西北大學(xué);2016年

7 彭藝芳;花生致敏糖蛋白Ara h1糖鏈決定簇的質(zhì)譜分析[D];西北大學(xué);2016年

8 周萬;氣道酸性微環(huán)境下OGR1介導(dǎo)黏蛋白5AC表達(dá)的研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2014年

9 馬恬然;禽流感病毒神經(jīng)氨酸酶的分離純化及其糖鏈譜研究[D];西北大學(xué);2013年

10 胡蓉;核酸適體電化學(xué)生物傳感器檢測黏蛋白的研究[D];湖北大學(xué);2014年

，

本文編號：1304082