本文關(guān)鍵詞：NADPH氧化酶在K-ras介導(dǎo)的胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用

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【摘要】：第一部分NADPH氧化酶活性抑制的p22phox敲除轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的培育及其表型目的:為去除胰腺腺泡組織中NADPH氧化酶(NOX)的活性,擬在小鼠胰腺腺泡細(xì)胞中進(jìn)行特異性的NOX的重要組分p22phox編碼基因的敲除,并驗(yàn)證該模型是否能夠在誘導(dǎo)突變后有效進(jìn)行基因剪切。此外,評(píng)價(jià)p22phox敲除小鼠和內(nèi)源性胰腺腺泡細(xì)胞特異性KrasG12D雜交后所的到的p22phox~(-/-)/Kras~(G12D/+)轉(zhuǎn)基因小鼠的胰腺組織表型。方法:首先獲得Loxp-Stop-Loxp調(diào)控p22phox編碼基因剪切的小鼠,與工具鼠fElaCreERT小鼠雜交,得到fElaCreERT;p22phox~(-/-)小鼠。該小鼠成年時(shí)予以Tamoxifen誘導(dǎo)突變表達(dá),后提取小鼠胰腺組織DNA擴(kuò)增相關(guān)片段后進(jìn)行電泳分析,明確p22phox編碼基因剪切情況。同時(shí),將fElaCreERT;p22phox~(-/-)小鼠與f Elas Cre ERT;Kras~(G12D/+)小鼠雜交以獲得f Elas Cre ERT;Kras~(G12D/+);p22phox~(-/-)小鼠。上述小鼠誘導(dǎo)突變后,表達(dá)后續(xù)目的基因突變。小鼠于150天齡處死,取胰腺組織進(jìn)行病理學(xué)表型的分析,并提取胰腺組織蛋白進(jìn)行Ras活性的檢測(cè)。結(jié)果:fElaCreERT;p22phox~(-/-)小鼠成功誘導(dǎo)突變,成為胰腺特異性p22phox~(-/-)小鼠。fElaCreERT;p22phox~(-/-)小鼠與f Elas Cre ERT;Kras~(G12D/+)小鼠雜交,并誘導(dǎo)突變后得到p22phox~(-/-)/Kras~(G12D/+)小鼠。對(duì)照組小鼠與p22phox~(-/-)小鼠對(duì)比,二者均未出現(xiàn)胰腺病變、膠原纖維沉積以及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。將Kras~(G12D/+)小鼠和p22phox~(-/-)/Kras~(G12D/+)小鼠對(duì)比,發(fā)現(xiàn)Kras~(G12D/+)小鼠出現(xiàn)腺泡導(dǎo)管化生、胰腺導(dǎo)管上皮內(nèi)瘤變、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以及炎癥因子表達(dá)增高,而p22phox~(-/-)/Kras~(G12D/+)小鼠僅小面積出現(xiàn)腺泡導(dǎo)管化生,胰腺導(dǎo)管上皮內(nèi)瘤變的發(fā)生也受到抑制。Ras活性檢測(cè)結(jié)果提示,Kras~(G12D/+)小鼠中活性Kras和活性Ras蛋白水平均增高,而p22phox~(-/-)/Kras~(G12D/+)小鼠的活性Kras、活性Ras蛋白水平則與對(duì)照組類似。結(jié)論:我們成功構(gòu)建了第一個(gè)p22phox胰腺腺泡細(xì)胞特異性敲除的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。與正常對(duì)照組相比,p22phox~(-/-)小鼠并未出現(xiàn)胰腺病變。此外,我們通過(guò)雜交成功獲得了p22phox~(-/-)/Kras~(G12D/+)胰腺腺泡細(xì)胞特異性敲除的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,與Kras~(G12D/+)小鼠相比,p22phox~(-/-)/Kras~(G12D/+)小鼠胰腺病變程度減輕,炎癥浸潤(rùn)和基質(zhì)形成均減少,Ras激活水平得到抑制。第二部分p22phox敲除對(duì)高脂飲食合并Kras突變所致胰腺癌的作用目的:內(nèi)源性的Kras突變不能夠獨(dú)立導(dǎo)致胰腺癌的發(fā)生,但可以與高脂飲食誘導(dǎo)的慢性炎癥協(xié)同導(dǎo)致胰腺癌的發(fā)生。為了明確NADPH氧化酶在Kras突變和高脂飲食協(xié)同致癌過(guò)程中的作用,在本部分中擬利用p22phox敲除的小鼠模型進(jìn)行探討。方法:分別培育獲得fElaCreERT小鼠,fElaCreERT;Kras~(G12D/+)小鼠以及fElaCreERT;Kras~(G12D/+);p22phox~(-/-)小鼠,并納入普通飲食或高脂飲食實(shí)驗(yàn)組,誘導(dǎo)小鼠突變后稱為Bac小鼠,KrasG12D+小鼠和p22phox~(-/-)/Kras~(G12D/+)小鼠,予相應(yīng)飲食處理。其中第一部分實(shí)驗(yàn)小鼠在達(dá)到150天齡時(shí)統(tǒng)一處死,取組織判斷胰腺病變程度、細(xì)胞增殖水平、腺泡細(xì)胞損失、炎癥浸潤(rùn)、胰腺星狀細(xì)胞激活水平以及ERK通路激活水平。另一部分實(shí)驗(yàn)小鼠予以相應(yīng)飲食處理后,長(zhǎng)期喂養(yǎng)至其自然死亡,以觀察不同處理組小鼠的生存期、胰腺癌轉(zhuǎn)移情況。結(jié)果:首先,在150天齡處死的小鼠中,我們發(fā)現(xiàn)共18只高脂飲食處理的Kras~(G12D/+)小鼠中有8只(44.44%)出現(xiàn)胰腺導(dǎo)管腺癌,所有小鼠均出現(xiàn)不同級(jí)別的Pan IN病變,高級(jí)別Pan IN病變多見(jiàn)。而共10只高脂飲食處理的p22phox~(-/-)/Kras~(G12D/+)小鼠中,無(wú)一例出現(xiàn)胰腺癌,8只出現(xiàn)Pan IN病變,而另外2只僅出現(xiàn)ADM病變。高脂飲食處理的Kras~(G12D/+)小鼠胰腺組織分析發(fā)現(xiàn),實(shí)質(zhì)細(xì)胞的增殖水平增高,表現(xiàn)為p16核染陽(yáng)性率明顯下降、Cyclin D1和Ki67陽(yáng)性染色細(xì)胞增多,基質(zhì)大量形成,膠原纖維沉積,星狀細(xì)胞激活,胰腺正常腺泡損失比例高,中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)包繞病變組織存在,實(shí)質(zhì)細(xì)胞炎癥因子COX2水平急劇升高。而高脂飲食處理的p22phox~(-/-)/Kras~(G12D/+)小鼠胰腺組織中,上述病理性改變程度輕。此外,高脂飲食喂養(yǎng)的p22phox~(-/-)/Kras~(G12D/+)小鼠胰腺組織中磷酸化ERK水平較Kras~(G12D/+)小鼠降低。在生存期觀察的實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)高脂飲食處理的p22phox~(-/-)/Kras~(G12D/+)小鼠生存期比高脂飲食處理的Kras~(G12D/+)小鼠明顯延長(zhǎng)。結(jié)論:由p22phox敲除導(dǎo)致NADPH氧化酶失活性,能夠減少胰腺組織中的ERK蛋白磷酸化,抑制Ras激活,減少基質(zhì)中的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),有效的延緩高脂飲食合并Kras突變所致胰腺細(xì)胞惡變并延長(zhǎng)小鼠的生存期。第三部分p22phox敲除對(duì)Kras突變協(xié)同胰腺炎癥刺激致癌作用的影響目的:本部分實(shí)驗(yàn)中,為了明確急性、慢性胰腺炎癥刺激與Kras突變的協(xié)同致癌作用能否被p22phox敲除所導(dǎo)致的NOX失活所抑制,我們采用了雨蛙素對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行急性炎癥刺激,并檢測(cè)不同基因型小鼠胰腺的急性損傷以及損傷恢復(fù)情況。另外,我們采用了COX2胰腺腺泡細(xì)胞過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠,判斷在COX2過(guò)表達(dá)造成胰腺持續(xù)性炎癥損傷與Kras突變的協(xié)同致癌過(guò)程中,p22phox敲除是否產(chǎn)生影響。方法:首先培育小鼠,得到fElaCreERT小鼠,fElaCreERT;Kras~(G12D/+)小鼠以及fElaCreERT;Kras~(G12D/+);p22phox~(-/-)小鼠,分別納入實(shí)驗(yàn)組,誘導(dǎo)突變后開始予以雨蛙素刺激。當(dāng)雨蛙素處理結(jié)束后,分別于處理完畢后24小時(shí)和第10天處死小鼠,用于觀察急性胰腺損傷以及損傷恢復(fù)情況。并采用Sirius Red染色法判斷膠原纖維沉積,采用CD45,F4/80和MPO特異性染色評(píng)價(jià)胰腺組織炎癥浸潤(rùn)水平。此外,量化評(píng)估了不同處理組小鼠腺泡細(xì)胞損失及胰腺星狀細(xì)胞激活情況。在COX2過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)中,我們培育了f Elas Cre ERT;COX2小鼠,f Elas Cre ERT;p22phox~(-/-)小鼠,f Elas Cre ERT;p22phox~(-/-);COX2小鼠;f Elas Cre ERT;COX2;Kras~(G12D/+)小鼠以及f Elas Cre ERT;p22phox~(-/-);COX2;Kras~(G12D/+)小鼠。上述五種基因型的小鼠于成年后誘導(dǎo)突變表達(dá),后分別于90天齡、180天齡和280天齡處死,取胰腺組織制成HE切片進(jìn)行觀察。結(jié)果:經(jīng)過(guò)雨蛙素誘導(dǎo)急性炎癥刺激后,Bac小鼠、Kras~(G12D/+)小鼠和p22phox~(-/-)/Kras~(G12D/+)小鼠在處理完畢1天后均出現(xiàn)胰腺急性炎癥損傷和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。而處理完畢后10天,Bac小鼠胰腺炎癥損傷恢復(fù);Kras~(G12D/+)小鼠胰腺則出現(xiàn)嚴(yán)重的纖維化,胰腺組織出現(xiàn)大量Pan IN病變,基質(zhì)中炎癥細(xì)胞大量浸潤(rùn),胰腺腺泡損失嚴(yán)重;p22phox~(-/-)/Kras~(G12D/+)小鼠則未見(jiàn)病變加重,上述病理表現(xiàn)并不明顯。在COX2過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)中,90天時(shí)處死的五個(gè)基因型小鼠均未見(jiàn)明顯病變;180天齡處死的五個(gè)基因型小鼠中,COX2小鼠出現(xiàn)ADM病變和少量的低級(jí)別Pan IN病變,但p22phox~(-/-)/COX2小鼠并未出現(xiàn)明顯的病變。COX2/Kras~(G12D/+)所有小鼠出現(xiàn)ADM和Pan IN病變,而p22phox~(-/-)/COX2/Kras~(G12D/+)小鼠出現(xiàn)ADM和少量低級(jí)別的Pan IN病變。280天齡時(shí),所有的COX2/Kras~(G12D/+)均出現(xiàn)PDAC,而10只p22phox~(-/-)/COX2/Kras~(G12D/+)小鼠中,僅有4只出現(xiàn)PDAC,其余表現(xiàn)為各種級(jí)別的Pan IN病變。結(jié)論:p22phox敲除能夠抑制Kras突變和雨蛙素導(dǎo)致的胰腺癌形成,阻止急性胰腺炎癥在致癌基因突變的背景下出現(xiàn)持續(xù)加重。而在COX2過(guò)表達(dá)和Kras協(xié)同作用導(dǎo)致胰腺癌的過(guò)程中,p22phox敲除能夠延緩PDAC的發(fā)生。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.9

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