本文關(guān)鍵詞：二甲雙胍上調(diào)βKlotho抑制雄激素相關(guān)的前列腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

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【摘要】：研究背景世界范圍內(nèi),前列腺癌在男性所有惡性腫瘤中發(fā)病率位居第二,在美國的發(fā)病率已經(jīng)超過肺癌,成為第一位危害男性健康的腫瘤,在我國其發(fā)病率也呈逐年上升的趨勢。早期患者可通過根治性手術(shù)或者根治性放療治愈。對于晚期前列腺癌,雄激素剝奪(androgen deprivation therapy,ADT)仍然是主要的治療方法。雖然初始治療階段ADT能有效抑制腫瘤生長,但是在2-3年內(nèi)超過一半的患者會發(fā)展到耐藥階段,也就是我們通常所知的去勢抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC),并且其中位生存期僅為12～18個月。雄激素受體(androgen receptor,AR)信號通路的持續(xù)激活仍然是CRPC發(fā)生、進展的關(guān)鍵因素。近年來有研究表明,上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)和AR信號通路存在著廣泛的串話,在前列腺癌發(fā)生以及進展為CRPC的過程中發(fā)揮著重要作用。雖然EMT和AR信號通路之間有著密切的聯(lián)系,但具體到調(diào)控機制,不同的研究者得出了不同甚至是矛盾的結(jié)論,仍需要進一步的實驗加以驗證。除AR信號通路外,其它一些信號通路也參與到前列腺癌EMT過程中,包括:RTK、Pten、STAT3、Wnt和Notch-hedgehog等。通過干擾上述信號通路,靶向逆轉(zhuǎn)EMT可能為以后前列腺癌的治療提供新的思路。成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)及其受體FGFR普遍存在于正常細胞中,共同構(gòu)成FGF信號通路,在細胞生長、分化、遷移、血管生成以及組織創(chuàng)傷修復(fù)中起重要作用。近年研究表明,該通路在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展中同樣發(fā)揮重要作用。其作用機制主要是通過激活一系列下游信號通路實現(xiàn),包括Ras-Raf-Mapk、PI3k-Akt、Stats和PLCγ等。大部分FGFs是通過自分泌或者旁分泌的方式發(fā)揮生理作用。FGF19亞科是FGFs家族中特殊的一類,包括FGF19、FGF21、FGF23,它們可通過類似激素的內(nèi)分泌功能入血從而調(diào)節(jié)許多生理功能,包括能量和膽汁酸的代謝,糖脂的代謝,以及維持磷、維生素D的動態(tài)平衡。有學(xué)者先后報道了 FGF19、FGF23能夠促進前列腺癌的進展。另有研究提示FGFR1的活化可以導(dǎo)致不可逆的前列腺腺癌和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,促進前列腺癌的進展。盡管大量研究把FGF/FGFR信號通路的激活和腫瘤的進展聯(lián)系起來,但是在一些特定的條件下,此通路的激活可以表現(xiàn)出抑制腫瘤的作用。此外,一系列的FGFs和FGFRs抑制劑已經(jīng)應(yīng)用在了前列腺癌的基礎(chǔ)和臨床試驗中,展現(xiàn)出其廣闊的應(yīng)用前景。FGF/FGFR信號通路的激活需要一個關(guān)鍵分子:βklotho(KLB)。βklotho作為FGF19、FGF21的共受體,可以提高FGF19、FGF21與FGFRs(特別是FGFR1和FGFR4)的親和性,形成βklotho-FGF19/FGF21-FGFR4復(fù)合體,發(fā)揮調(diào)節(jié)血糖、膽汁酸、能量代謝的生理作用。βklotho目前在腫瘤中的研究較少,并且其到底是發(fā)揮促癌還是抑癌作用仍存在爭議。雖然FGF19/FGFR4信號通路能夠促進前列腺癌的進展,但是作為FGF19/FGFR4共受體,βklotho在前列腺癌的表達以及βklotho與前列腺生物學(xué)行為的關(guān)系還未有報道。二甲雙胍是世界范圍內(nèi)治療2型糖尿病應(yīng)用最廣泛的藥物。流行病學(xué)研究表明,二甲雙胍可以降低多種腫瘤的發(fā)病率和疾病進展率。目前已有大量體內(nèi)、體外研究表明二甲雙胍具有廣泛的抗腫瘤作用,主要和激活A(yù)MPK(AMP-activated protein kinase)通路和增加胰島素敏感性有關(guān)。有研究表明AMPK和AR之間存在負反饋調(diào)節(jié),二甲雙胍可下調(diào)AR表達,抑制前列腺癌的生長。除此之外,二甲雙狐在多種腫瘤(包括前列腺癌)的研究中表現(xiàn)出了抗EMT的作用。雖然目前已有大量的二甲雙胍抑制腫瘤發(fā)生、進展的研究,但是近年的研究熱度仍然不減,二甲雙胍抗腫瘤的新機制層出不窮。研究表明βKlotho與FGF19-FGFRs形成復(fù)合體,具有和二甲雙胍類似的降血糖作用,二甲雙胍和βKlotho之間是否具有潛在聯(lián)系,目前還未見報道。第一部分:βKlotho抑制雄激素相關(guān)的前列腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化目的首先研究雄激素/雄激素受體信號通路與前列腺癌EMT的關(guān)系,檢測βklotho的表達水平與前列腺癌患者臨床參數(shù)以及預(yù)后的關(guān)系,進而在體內(nèi)、體外實驗中探討βklotho與前列腺癌EMT的關(guān)系,從而發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)EMT的潛在靶點。方法1.采用Western Blot檢測雙氫睪酮(dihydrotestosterone,DHT)對于AR陰性細胞系PC3和AR陽性細胞系LNCaP EMT的影響。2.采用Western Blot檢測βKlotho在不同前列腺癌細胞系中的表達,免疫組織化學(xué)檢測βKlotho在前列腺增生和前列腺癌組織中的表達。The Human Protein Altas數(shù)據(jù)庫分析βKlotho在正常前列腺組織和前列腺癌中的表達。3.采用卡方檢驗檢測βKlotho表達水平與前列腺癌患者年齡、腫瘤分期、分級的相關(guān)性;通過Kaplan-Meier單因素生存分析法檢測腫瘤分期、分級、βKlotho表達水平與生存預(yù)后的關(guān)系。4.采用CCK-8、克隆形成實驗檢測βKlotho對于前列腺癌細胞系增殖的影響;采用Transwe丨1、細胞劃痕實驗檢測βKlotho對于細胞遷移、侵襲能力的影響;通過流式細胞儀檢測Annexin V-PE/7-AAD染色情況評估細胞的早期凋亡。5.采用Western Blot、細胞免疫熒光法檢測過表達和敲減βKlotho對前列腺癌細胞EMT的影響。6.裸鼠成瘤實驗檢測βKlotho對于前列腺腫瘤生長的影響,免疫組織化學(xué)檢測βKlotho對于裸鼠前列腺癌EMT的影響。結(jié)果1.DHT能夠顯著下調(diào)AR陰性的PC3細胞上皮標記物E-cadherin的表達(p0.01),上調(diào)間質(zhì)標記物 N-caderin(p0.05)、vimentin(p0.05)的表達,上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子slug、snail(P0.05)的表達。DHT能夠激活ERK1/2,MAPK/EPK1/2抑制劑U0126能夠反轉(zhuǎn)DHT所致的上述EMT標記物的變化。在AR陽性的LNCaP細胞中,DHT刺激對EMT指標無明顯作用。2.βKlotho在PC3、LNCaP、C4-2B三種細胞中均有表達,以LNCaP中的表達量最高,其表達量是PC3的2.24倍(p0.01),是C4-2B的1.67倍(p0.01)。30例前列腺增生βKlotho的染色得分:10.15±0.29,30例前列腺癌βKlotho的染色得分:7.47±0.41,兩者的差異表達具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),高級別(Gleason評分≥7分)患者比低級別(Gleason評分≤6)患者的βKlotho表達量更低。通過對The Human Protein Altas數(shù)據(jù)庫分析,發(fā)現(xiàn)前列腺癌中的βKlotho較正常前列腺組織的表達降低,與我們的研究結(jié)果一致。3.卡方檢驗表明βKlotho的低表達與前列腺癌的高分級有關(guān)(p0.05)。βKlotho表達水平與患者的年齡、臨床分期無關(guān)(p0.05)。Kaplan-Meier生存分析法,log-rank檢驗表明βKlotho低表達患者生存率明顯低于βKlotho中等表達和高表達患者。腫瘤高分期比低分期預(yù)后差,高分級與低分級之間無統(tǒng)計學(xué)差異。4.PC3細胞中過表達βKlotho顯著降低細胞的增殖能力,增加細胞的早期凋亡,抑制細胞的遷移、侵襲能力。LNCaP細胞中敲減βKlotho能夠促進細胞增殖,抑制細胞早期凋亡,促進細胞的遷移與侵襲能力。5.在PC3細胞中過表達βKlotho后能顯著上調(diào)DHT所誘導(dǎo)的E-cadherin的降低作用(p0.05),下調(diào) DHT 所誘導(dǎo)的 N-cadherin、vimentin、slug、snail 的升高作用,這種效應(yīng)在細胞免疫熒光實驗中得到證實;LNCaP細胞敲減βKlotho后E-cadherin表達降低,N-cadherin、vimentin的表達升高,這種效應(yīng)在細胞免疫熒光實驗中得到證實。6.裸鼠成瘤4周后,對照組的腫瘤體積為2436±790(mm3),βKlotho過表達組腫瘤體積為1590±504(mm3),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01)。βKlotho的過表達明顯抑制PC3細胞的皮下移植瘤的生長。免疫組織化學(xué)表明,βKlotho過表達的裸鼠移植瘤中E-cadherin的表達增高了 2.68倍(p0.01),N-cadherin的表達降低了 69.7%(p0.01),snail 的表達降低了 46.1%(p0.01)。結(jié)論1.雄激素對前列腺癌EMT的影響是AR依賴性途徑和AR非依賴性途徑綜合作用的結(jié)果。2.前列腺癌細胞系、前列腺癌組織中均存在βKlotho的表達,前列腺癌βKlotho表達較前列腺增生組織降低,βKlotho的低表達與前列腺癌的高分級有關(guān),βKlotho的表達降低是前列腺癌患者生存的不利因素。3.βKlothot通過抑制ERK1/2信號通路抑制雄激素/雄激素受體相關(guān)的EMT,在體內(nèi)、體外實驗中發(fā)揮抗前列腺癌作用。4.βKlotho作為EMT的抑制因子,可作為晚期前列腺癌治療的一個新的潛在靶點。第二部分:二甲雙胍上調(diào)βKlotho抑制前列腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化目的首先研究二甲雙胍與前列腺癌EMT、與前列腺癌AR信號通路之間的關(guān)系。鑒于二甲雙胍與βKlotho均有降低血糖的作用,進一步研究兩者潛在的關(guān)系,并對其機制作初步探究。方法1.采用克隆形成實驗、CCK8檢測二甲雙胍對于PC3、LNCaP細胞增殖的影響。2.采用Western Blot檢測二甲雙狐對βKlotho,對EMT的影響。3.采用組織塊培養(yǎng)方法檢測二甲雙胍對EMT的影響。4.采用RT-PCR檢測二甲雙胍對于AR轉(zhuǎn)錄活性的影響。5.采用細胞免疫熒光方法檢測二甲雙胍對于AR細胞分布的影響。6.GEO數(shù)據(jù)庫分析AR蛋白與βKlotho DNA潛在聯(lián)系。結(jié)果1.二甲雙胍抑制PC3、LNCaP細胞增殖,具有濃度和時間依賴性。2.在PC3細胞中,二甲雙胍能明顯激活A(yù)MPK信號通路,降低AR的表達,上調(diào)E-cadherin的表達,下調(diào)N-cadherin的表達,這種效應(yīng)在組織塊培養(yǎng)中得到證實。有趣的是,二甲雙胍能夠明顯上調(diào)βKlotho的表達,具有濃度依賴性。在PC3細胞中敲減βKlotho后,二甲雙胍所致的E-cadherin的上調(diào),N-cadherin的下調(diào)被逆轉(zhuǎn)。3.二甲雙胍能夠抑制DHT所致的LNCaP細胞AR轉(zhuǎn)錄的激活,包括AR以及下游PSA、NKX3.1mRNA水平的降低。并且,二甲雙胍能夠抑制AR從細胞質(zhì)到細胞核的轉(zhuǎn)運。4.GEO數(shù)據(jù)庫分析提示AR蛋白與βKlotho DNA在外顯子1和外顯子2之間存在結(jié)合位點,DHT能夠促進AR蛋白與βKlotho DNA的結(jié)合,而抗雄藥物恩雜魯胺能反轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。結(jié)論1.二甲雙狐抑制前列腺癌細胞的增殖,上調(diào)βKlotho表達,抑制前列腺癌細胞的EMT,這種效應(yīng)依賴于βKlotho的表達。2.二甲雙胍抑制AR信號通路的活性。3.二甲雙胍上調(diào)βKlotho的可能機制:二甲雙胍通過下調(diào)AR的表達,抑制AR對于βKlotho啟動子區(qū)域的抑制作用,刺激βKlotho轉(zhuǎn)錄、翻譯,上調(diào)βKlotho表達。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R737.25
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本文編號：1302604