發(fā)布時(shí)間：2017-12-18 03:19

  本文關(guān)鍵詞：二甲雙胍上調(diào)βKlotho抑制雄激素相關(guān)的前列腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

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【摘要】：研究背景世界范圍內(nèi),前列腺癌在男性所有惡性腫瘤中發(fā)病率位居第二,在美國(guó)的發(fā)病率已經(jīng)超過(guò)肺癌,成為第一位危害男性健康的腫瘤,在我國(guó)其發(fā)病率也呈逐年上升的趨勢(shì)。早期患者可通過(guò)根治性手術(shù)或者根治性放療治愈。對(duì)于晚期前列腺癌,雄激素剝奪(androgen deprivation therapy,ADT)仍然是主要的治療方法。雖然初始治療階段ADT能有效抑制腫瘤生長(zhǎng),但是在2-3年內(nèi)超過(guò)一半的患者會(huì)發(fā)展到耐藥階段,也就是我們通常所知的去勢(shì)抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC),并且其中位生存期僅為12～18個(gè)月。雄激素受體(androgen receptor,AR)信號(hào)通路的持續(xù)激活仍然是CRPC發(fā)生、進(jìn)展的關(guān)鍵因素。近年來(lái)有研究表明,上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)和AR信號(hào)通路存在著廣泛的串話,在前列腺癌發(fā)生以及進(jìn)展為CRPC的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。雖然EMT和AR信號(hào)通路之間有著密切的聯(lián)系,但具體到調(diào)控機(jī)制,不同的研究者得出了不同甚至是矛盾的結(jié)論,仍需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。除AR信號(hào)通路外,其它一些信號(hào)通路也參與到前列腺癌EMT過(guò)程中,包括:RTK、Pten、STAT3、Wnt和Notch-hedgehog等。通過(guò)干擾上述信號(hào)通路,靶向逆轉(zhuǎn)EMT可能為以后前列腺癌的治療提供新的思路。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor,FGF)及其受體FGFR普遍存在于正常細(xì)胞中,共同構(gòu)成FGF信號(hào)通路,在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、遷移、血管生成以及組織創(chuàng)傷修復(fù)中起重要作用。近年研究表明,該通路在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展中同樣發(fā)揮重要作用。其作用機(jī)制主要是通過(guò)激活一系列下游信號(hào)通路實(shí)現(xiàn),包括Ras-Raf-Mapk、PI3k-Akt、Stats和PLCγ等。大部分FGFs是通過(guò)自分泌或者旁分泌的方式發(fā)揮生理作用。FGF19亞科是FGFs家族中特殊的一類,包括FGF19、FGF21、FGF23,它們可通過(guò)類似激素的內(nèi)分泌功能入血從而調(diào)節(jié)許多生理功能,包括能量和膽汁酸的代謝,糖脂的代謝,以及維持磷、維生素D的動(dòng)態(tài)平衡。有學(xué)者先后報(bào)道了 FGF19、FGF23能夠促進(jìn)前列腺癌的進(jìn)展。另有研究提示FGFR1的活化可以導(dǎo)致不可逆的前列腺腺癌和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,促進(jìn)前列腺癌的進(jìn)展。盡管大量研究把FGF/FGFR信號(hào)通路的激活和腫瘤的進(jìn)展聯(lián)系起來(lái),但是在一些特定的條件下,此通路的激活可以表現(xiàn)出抑制腫瘤的作用。此外,一系列的FGFs和FGFRs抑制劑已經(jīng)應(yīng)用在了前列腺癌的基礎(chǔ)和臨床試驗(yàn)中,展現(xiàn)出其廣闊的應(yīng)用前景。FGF/FGFR信號(hào)通路的激活需要一個(gè)關(guān)鍵分子:βklotho(KLB)。βklotho作為FGF19、FGF21的共受體,可以提高FGF19、FGF21與FGFRs(特別是FGFR1和FGFR4)的親和性,形成βklotho-FGF19/FGF21-FGFR4復(fù)合體,發(fā)揮調(diào)節(jié)血糖、膽汁酸、能量代謝的生理作用。βklotho目前在腫瘤中的研究較少,并且其到底是發(fā)揮促癌還是抑癌作用仍存在爭(zhēng)議。雖然FGF19/FGFR4信號(hào)通路能夠促進(jìn)前列腺癌的進(jìn)展,但是作為FGF19/FGFR4共受體,βklotho在前列腺癌的表達(dá)以及βklotho與前列腺生物學(xué)行為的關(guān)系還未有報(bào)道。二甲雙胍是世界范圍內(nèi)治療2型糖尿病應(yīng)用最廣泛的藥物。流行病學(xué)研究表明,二甲雙胍可以降低多種腫瘤的發(fā)病率和疾病進(jìn)展率。目前已有大量體內(nèi)、體外研究表明二甲雙胍具有廣泛的抗腫瘤作用,主要和激活A(yù)MPK(AMP-activated protein kinase)通路和增加胰島素敏感性有關(guān)。有研究表明AMPK和AR之間存在負(fù)反饋調(diào)節(jié),二甲雙胍可下調(diào)AR表達(dá),抑制前列腺癌的生長(zhǎng)。除此之外,二甲雙狐在多種腫瘤(包括前列腺癌)的研究中表現(xiàn)出了抗EMT的作用。雖然目前已有大量的二甲雙胍抑制腫瘤發(fā)生、進(jìn)展的研究,但是近年的研究熱度仍然不減,二甲雙胍抗腫瘤的新機(jī)制層出不窮。研究表明βKlotho與FGF19-FGFRs形成復(fù)合體,具有和二甲雙胍類似的降血糖作用,二甲雙胍和βKlotho之間是否具有潛在聯(lián)系,目前還未見(jiàn)報(bào)道。第一部分:βKlotho抑制雄激素相關(guān)的前列腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化目的首先研究雄激素/雄激素受體信號(hào)通路與前列腺癌EMT的關(guān)系,檢測(cè)βklotho的表達(dá)水平與前列腺癌患者臨床參數(shù)以及預(yù)后的關(guān)系,進(jìn)而在體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)中探討βklotho與前列腺癌EMT的關(guān)系,從而發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)EMT的潛在靶點(diǎn)。方法1.采用Western Blot檢測(cè)雙氫睪酮(dihydrotestosterone,DHT)對(duì)于AR陰性細(xì)胞系PC3和AR陽(yáng)性細(xì)胞系LNCaP EMT的影響。2.采用Western Blot檢測(cè)βKlotho在不同前列腺癌細(xì)胞系中的表達(dá),免疫組織化學(xué)檢測(cè)βKlotho在前列腺增生和前列腺癌組織中的表達(dá)。The Human Protein Altas數(shù)據(jù)庫(kù)分析βKlotho在正常前列腺組織和前列腺癌中的表達(dá)。3.采用卡方檢驗(yàn)檢測(cè)βKlotho表達(dá)水平與前列腺癌患者年齡、腫瘤分期、分級(jí)的相關(guān)性;通過(guò)Kaplan-Meier單因素生存分析法檢測(cè)腫瘤分期、分級(jí)、βKlotho表達(dá)水平與生存預(yù)后的關(guān)系。4.采用CCK-8、克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)βKlotho對(duì)于前列腺癌細(xì)胞系增殖的影響;采用Transwe丨1、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)βKlotho對(duì)于細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響;通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)Annexin V-PE/7-AAD染色情況評(píng)估細(xì)胞的早期凋亡。5.采用Western Blot、細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)過(guò)表達(dá)和敲減βKlotho對(duì)前列腺癌細(xì)胞EMT的影響。6.裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)βKlotho對(duì)于前列腺腫瘤生長(zhǎng)的影響,免疫組織化學(xué)檢測(cè)βKlotho對(duì)于裸鼠前列腺癌EMT的影響。結(jié)果1.DHT能夠顯著下調(diào)AR陰性的PC3細(xì)胞上皮標(biāo)記物E-cadherin的表達(dá)(p0.01),上調(diào)間質(zhì)標(biāo)記物 N-caderin(p0.05)、vimentin(p0.05)的表達(dá),上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子slug、snail(P0.05)的表達(dá)。DHT能夠激活ERK1/2,MAPK/EPK1/2抑制劑U0126能夠反轉(zhuǎn)DHT所致的上述EMT標(biāo)記物的變化。在AR陽(yáng)性的LNCaP細(xì)胞中,DHT刺激對(duì)EMT指標(biāo)無(wú)明顯作用。2.βKlotho在PC3、LNCaP、C4-2B三種細(xì)胞中均有表達(dá),以LNCaP中的表達(dá)量最高,其表達(dá)量是PC3的2.24倍(p0.01),是C4-2B的1.67倍(p0.01)。30例前列腺增生βKlotho的染色得分:10.15±0.29,30例前列腺癌βKlotho的染色得分:7.47±0.41,兩者的差異表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),高級(jí)別(Gleason評(píng)分≥7分)患者比低級(jí)別(Gleason評(píng)分≤6)患者的βKlotho表達(dá)量更低。通過(guò)對(duì)The Human Protein Altas數(shù)據(jù)庫(kù)分析,發(fā)現(xiàn)前列腺癌中的βKlotho較正常前列腺組織的表達(dá)降低,與我們的研究結(jié)果一致。3.卡方檢驗(yàn)表明βKlotho的低表達(dá)與前列腺癌的高分級(jí)有關(guān)(p0.05)。βKlotho表達(dá)水平與患者的年齡、臨床分期無(wú)關(guān)(p0.05)。Kaplan-Meier生存分析法,log-rank檢驗(yàn)表明βKlotho低表達(dá)患者生存率明顯低于βKlotho中等表達(dá)和高表達(dá)患者。腫瘤高分期比低分期預(yù)后差,高分級(jí)與低分級(jí)之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。4.PC3細(xì)胞中過(guò)表達(dá)βKlotho顯著降低細(xì)胞的增殖能力,增加細(xì)胞的早期凋亡,抑制細(xì)胞的遷移、侵襲能力。LNCaP細(xì)胞中敲減βKlotho能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞早期凋亡,促進(jìn)細(xì)胞的遷移與侵襲能力。5.在PC3細(xì)胞中過(guò)表達(dá)βKlotho后能顯著上調(diào)DHT所誘導(dǎo)的E-cadherin的降低作用(p0.05),下調(diào) DHT 所誘導(dǎo)的 N-cadherin、vimentin、slug、snail 的升高作用,這種效應(yīng)在細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí);LNCaP細(xì)胞敲減βKlotho后E-cadherin表達(dá)降低,N-cadherin、vimentin的表達(dá)升高,這種效應(yīng)在細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。6.裸鼠成瘤4周后,對(duì)照組的腫瘤體積為2436±790(mm3),βKlotho過(guò)表達(dá)組腫瘤體積為1590±504(mm3),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。βKlotho的過(guò)表達(dá)明顯抑制PC3細(xì)胞的皮下移植瘤的生長(zhǎng)。免疫組織化學(xué)表明,βKlotho過(guò)表達(dá)的裸鼠移植瘤中E-cadherin的表達(dá)增高了 2.68倍(p0.01),N-cadherin的表達(dá)降低了 69.7%(p0.01),snail 的表達(dá)降低了 46.1%(p0.01)。結(jié)論1.雄激素對(duì)前列腺癌EMT的影響是AR依賴性途徑和AR非依賴性途徑綜合作用的結(jié)果。2.前列腺癌細(xì)胞系、前列腺癌組織中均存在βKlotho的表達(dá),前列腺癌βKlotho表達(dá)較前列腺增生組織降低,βKlotho的低表達(dá)與前列腺癌的高分級(jí)有關(guān),βKlotho的表達(dá)降低是前列腺癌患者生存的不利因素。3.βKlothot通過(guò)抑制ERK1/2信號(hào)通路抑制雄激素/雄激素受體相關(guān)的EMT,在體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮抗前列腺癌作用。4.βKlotho作為EMT的抑制因子,可作為晚期前列腺癌治療的一個(gè)新的潛在靶點(diǎn)。第二部分:二甲雙胍上調(diào)βKlotho抑制前列腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化目的首先研究二甲雙胍與前列腺癌EMT、與前列腺癌AR信號(hào)通路之間的關(guān)系。鑒于二甲雙胍與βKlotho均有降低血糖的作用,進(jìn)一步研究?jī)烧邼撛诘年P(guān)系,并對(duì)其機(jī)制作初步探究。方法1.采用克隆形成實(shí)驗(yàn)、CCK8檢測(cè)二甲雙胍對(duì)于PC3、LNCaP細(xì)胞增殖的影響。2.采用Western Blot檢測(cè)二甲雙狐對(duì)βKlotho,對(duì)EMT的影響。3.采用組織塊培養(yǎng)方法檢測(cè)二甲雙胍對(duì)EMT的影響。4.采用RT-PCR檢測(cè)二甲雙胍對(duì)于AR轉(zhuǎn)錄活性的影響。5.采用細(xì)胞免疫熒光方法檢測(cè)二甲雙胍對(duì)于AR細(xì)胞分布的影響。6.GEO數(shù)據(jù)庫(kù)分析AR蛋白與βKlotho DNA潛在聯(lián)系。結(jié)果1.二甲雙胍抑制PC3、LNCaP細(xì)胞增殖,具有濃度和時(shí)間依賴性。2.在PC3細(xì)胞中,二甲雙胍能明顯激活A(yù)MPK信號(hào)通路,降低AR的表達(dá),上調(diào)E-cadherin的表達(dá),下調(diào)N-cadherin的表達(dá),這種效應(yīng)在組織塊培養(yǎng)中得到證實(shí)。有趣的是,二甲雙胍能夠明顯上調(diào)βKlotho的表達(dá),具有濃度依賴性。在PC3細(xì)胞中敲減βKlotho后,二甲雙胍所致的E-cadherin的上調(diào),N-cadherin的下調(diào)被逆轉(zhuǎn)。3.二甲雙胍能夠抑制DHT所致的LNCaP細(xì)胞AR轉(zhuǎn)錄的激活,包括AR以及下游PSA、NKX3.1mRNA水平的降低。并且,二甲雙胍能夠抑制AR從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)。4.GEO數(shù)據(jù)庫(kù)分析提示AR蛋白與βKlotho DNA在外顯子1和外顯子2之間存在結(jié)合位點(diǎn),DHT能夠促進(jìn)AR蛋白與βKlotho DNA的結(jié)合,而抗雄藥物恩雜魯胺能反轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。結(jié)論1.二甲雙狐抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖,上調(diào)βKlotho表達(dá),抑制前列腺癌細(xì)胞的EMT,這種效應(yīng)依賴于βKlotho的表達(dá)。2.二甲雙胍抑制AR信號(hào)通路的活性。3.二甲雙胍上調(diào)βKlotho的可能機(jī)制:二甲雙胍通過(guò)下調(diào)AR的表達(dá),抑制AR對(duì)于βKlotho啟動(dòng)子區(qū)域的抑制作用,刺激βKlotho轉(zhuǎn)錄、翻譯,上調(diào)βKlotho表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R737.25
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本文編號(hào)：1302604