發(fā)布時(shí)間：2017-12-17 21:27

  本文關(guān)鍵詞：Tfh細(xì)胞調(diào)控B細(xì)胞分化及其對移植排斥反應(yīng)作用的機(jī)制研究

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【摘要】：在我們?nèi)祟愘囈陨娴耐猸h(huán)境中,存在著大量對人類有害的微生物,如病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲及原生動(dòng)物等,而當(dāng)上述微生物入侵人體,這些外源生物性刺激將會引起機(jī)體免疫性應(yīng)答。而機(jī)體的免疫系統(tǒng)能夠識別外來入侵的關(guān)鍵是它可以識別這些微生物上的特異性標(biāo)志——抗原。而器官移植,一項(xiàng)發(fā)展不過百年卻又作為當(dāng)今治療臟器終末期疾病的主要方法之一,也會將移植物上的外來性抗原帶入受者體內(nèi),而受者的免疫系統(tǒng)通過對這些外來性抗原的識別,會產(chǎn)生特異性的免疫應(yīng)答,即移植排斥反應(yīng)。經(jīng)過數(shù)十年的研究,移植排斥反應(yīng)被分為了兩大種類,即細(xì)胞性排斥反應(yīng)及體液性排斥反應(yīng)。細(xì)胞性排斥反應(yīng)常見于在急性排斥反應(yīng)中,是機(jī)體在在移植物外來抗原的刺激下,T淋巴細(xì)胞識別抗原而大量激活、合并IL-2等促炎性細(xì)胞因子的生成增加,激活的T細(xì)胞大量增殖,引起了以T細(xì)胞為主的對移植物的排斥反應(yīng)。當(dāng)供體器官經(jīng)移植手術(shù)植入受者體內(nèi),由于供體和受者之間的組織相容性抗原(MHC)的不同,受體外周循環(huán)中的T淋巴細(xì)胞識別移植物的抗原而獲得第一信號激活,隨后進(jìn)入附近的外周免疫器官(脾臟或淋巴結(jié))中,一部分轉(zhuǎn)化形成淋巴母細(xì)胞,并迅速增殖分化為具有活性可識別抗原的致敏性T淋巴細(xì)胞。其中CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞可以通過識別抗原引起細(xì)胞溶解直接對移植物造成損傷,而CD4+T輔助細(xì)胞則可以合成釋放多種細(xì)胞因子(IL-2、IL-6、IFN-γ)等,通過具有直接殺傷作用的亞群直接或通過輔助CD8+T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞等間接作用于移植物造成損傷。而體液性排斥反應(yīng)則是由B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)(或DC識別抗原啟動(dòng)),首先B細(xì)胞經(jīng)BCR(B cell receptor,BCR)特異性識別移植物表面抗原,激活第一信號;激活B細(xì)胞的第二信號即協(xié)同刺激信號則是由T輔助細(xì)胞與B細(xì)胞相互作用所提供的。激活的的B細(xì)胞隨后進(jìn)入生發(fā)中心,在T輔助細(xì)胞的協(xié)助下經(jīng)過一系列分化過程形成漿細(xì)胞或記憶性B細(xì)胞,并通過漿細(xì)胞產(chǎn)生大量高親和力抗體對移植物產(chǎn)生殺傷作用。傳統(tǒng)免疫學(xué)的經(jīng)典理論認(rèn)為,針對TD抗原的抗體免疫應(yīng)答是需要CD4+T細(xì)胞的輔助。CD4+T細(xì)胞在B細(xì)胞活化及體液免疫中發(fā)揮了十分重要的作用,傳統(tǒng)理論認(rèn)為,Th2細(xì)胞通過CD40/CD40L、CD28/B7與B細(xì)胞相互作用,并通過分泌IL-4、IL-2等來發(fā)揮輔助B細(xì)胞活化的作用。但B細(xì)胞活化后在外周免疫器官的生發(fā)中心中須經(jīng)過體細(xì)胞突變、親和力成熟、受體編輯和類型轉(zhuǎn)換等過程,這些過程是否需要T細(xì)胞的輔助以及如何輔助或調(diào)控的機(jī)制尚沒有研究透徹。通過近年的研究,濾泡輔助性T細(xì)胞(Follicular helper T cells,Tfh)亞群作為在生發(fā)中心內(nèi)真正輔助B細(xì)胞分化的功能已得到了驗(yàn)證,而Tfh自身的分化過程也有了一定了解,但Tfh細(xì)胞輔助B細(xì)胞的機(jī)制并未完全揭示。目前研究顯示,IL-21敲除小鼠出現(xiàn)Tfh細(xì)胞分化障礙,并影響了進(jìn)一步的GC形成及抗體生成,因此,IL-21是Tfh細(xì)胞分化過程中的必須因子之一。針對Tfh分化過程中的此特點(diǎn),我們希望通過以Tfh為靶點(diǎn),通過阻斷IL-21通路抑制體液性排斥反應(yīng),從而保護(hù)達(dá)到移植物的作用。一、Tfh細(xì)胞調(diào)控B細(xì)胞分化的機(jī)制在第一部分中,我們首先通過提取小鼠脾臟T細(xì)胞并應(yīng)用IL-21對其進(jìn)行刺激,通過蛋白印跡檢測,IL-21可以明顯活化T細(xì)胞內(nèi)的STAT3通路,證明IL-21在小鼠脾臟內(nèi)是通過活化T細(xì)胞內(nèi)STAT3通路提供給T細(xì)胞向Tfh細(xì)胞分化的信號。進(jìn)一步研究我們希望通過IL-21R-Fc阻斷IL-21對T細(xì)胞的刺激作用,因此我們先用IL-21R-Fc對T細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理,再進(jìn)一步使用IL-21對其進(jìn)行刺激,結(jié)果表明,在IL-21R-Fc濃度為10ng/ml時(shí)可完全阻斷IL-21對T細(xì)胞內(nèi)STAT3的激活。進(jìn)一步研究我們通過小鼠體液性免疫(SRBC免疫)模型,研究使用IL-21R-Fc阻斷IL-21信號通路后,對Tfh細(xì)胞分化的影響。在對不同處理的小鼠使用SRBC免疫后7天,首先對外周血中成熟B細(xì)胞的比例進(jìn)行檢測,結(jié)果無明顯差異,證明IL-21-Fc并未對B細(xì)胞在骨髓中的分化產(chǎn)生影響;通過檢測小鼠脾臟中Tfh細(xì)胞分化結(jié)果顯示,IL-21R-Fc明顯抑制了SRBC免疫后的Tfh細(xì)胞分化;通過對脾臟內(nèi)生發(fā)中心的分析顯示,Tfh細(xì)胞分化收到抑制后,生發(fā)中心的形成明顯降低;對邊緣區(qū)B細(xì)胞及濾泡B細(xì)胞的分析發(fā)現(xiàn),濾泡B細(xì)胞的數(shù)量在IL-21R-Fc處理后大大減少,證明SRBC免疫后的反應(yīng)為特異性體液免疫反應(yīng),且此反應(yīng)收到了抑制;對外周血中的漿細(xì)胞及抗體量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),IL-21R-Fc處理后漿細(xì)胞數(shù)量及抗體滴度都大大降低,直接證明了IL-21R-Fc對體液性免疫反應(yīng)的抑制作用。二、Tfh細(xì)胞調(diào)控體液性排斥反應(yīng)的作用及機(jī)制通過第一部分的實(shí)驗(yàn),證明了IL-21R-Fc對Tfh細(xì)胞分化的抑制作用,因此,第二部分的實(shí)驗(yàn)我們使用IL-21R-Fc處理受體小鼠并進(jìn)行心臟異位移植。在小鼠心臟移植后的急性排斥反應(yīng)中,我們通過受體的血清漿細(xì)胞數(shù)量及抗體滴度的增加、移植物的Ig G及C4d沉積程度增加,證明小鼠心臟移植后的急性排斥反應(yīng)有體液免疫的參加。而通過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)使用IL-21R-Fc處理后的小鼠移植物生存期延長;移植物的心肌排列相對較好,心肌細(xì)胞水腫壞死減輕,炎癥細(xì)胞浸潤明顯降低,血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹程度較輕,炎癥細(xì)胞浸潤降低,證明其組織損傷降低;TUNEL結(jié)果IL-21R-Fc處理使心肌細(xì)胞的凋亡也有所降低;而通過體液性排斥反應(yīng)診斷的金標(biāo)準(zhǔn)C4d的檢測也明確表明IL-21R-Fc處理后的移植物內(nèi)C4d的浸潤明顯降低;通過對受體外周血的檢測,其血漿內(nèi)漿細(xì)胞數(shù)量及抗體滴度也明顯降低。所有的結(jié)果都證明,IL-21R-Fc對小鼠心臟移植后的體液排斥反應(yīng)具有抑制作用。進(jìn)一步我們對移植后受體的脾臟進(jìn)行流式分析發(fā)現(xiàn),IL-21R-Fc處理后小鼠移植后脾臟內(nèi)Tfh細(xì)胞數(shù)量明顯降低,生發(fā)中心的形成也受到了抑制。這與第一部分的結(jié)果相符合,證明了IL-21R-Fc在心臟移植中也可以移植Tfh細(xì)胞的分化。綜上所述,我們首先通過IL-21刺激小鼠脾臟T細(xì)胞證明了其通過激活STAT3通路作用,而IL-21R-Fc可以阻斷這種作用;利用小鼠體液免疫模型,我們證明了IL-21R-Fc可以通過阻斷IL-21通路抑制Tfh的分化,進(jìn)一步抑制了生發(fā)中心的形成,使B細(xì)胞分化成為漿細(xì)胞和記憶性B細(xì)胞的過程受到抑制,導(dǎo)致了抗體生成減少,從而減輕體液性免疫反應(yīng);進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)我們利用小鼠異位心臟移植急性排斥模型,證明體液免疫參與其中,而IL-21R-Fc可以通過抑制Tfh的分化進(jìn)一步抑制抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng),為臨床體液性排斥反應(yīng)的治療提供了新思路。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R392.4

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本文編號：1301627