本文關(guān)鍵詞：低氧下Cdc6調(diào)控E7表達(dá)細(xì)胞越過G1期阻滯的研究與新式HPV-16病毒整合位點檢測方法的建立

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【摘要】：第一部分:低氧下Cdc6調(diào)控E7表達(dá)細(xì)胞越過G1期阻滯的研究研究目的:人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)感染是全球最常見的性傳播疾病之一。高危型HPV是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的首要啟動因子。盡管目前HPV預(yù)防性疫苗已經(jīng)上市,但對于已經(jīng)感染或患有免疫抑制病的病人無效。高危型HPV的致病機(jī)制尚未完全闡明,因此深入理解HPV的致病機(jī)制仍然是有效防治宮頸癌及其它相關(guān)癌癥的重要前提。HPV-16是感染率最高的高危HPV型別,在多數(shù)宮頸癌患者中表達(dá)。HPV的惡性轉(zhuǎn)化功能主要依賴于其早期蛋白E6和E7,E6和E7分別通過降解p53和pRb抑癌蛋白導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂,細(xì)胞異常增殖。此外,E7的表達(dá)還能引起宿主細(xì)胞DNA損傷及基因組不穩(wěn)定。研究證實HPV-16 E7的持續(xù)性表達(dá)對于宮頸癌前病變及宮頸癌的形成及發(fā)展均至關(guān)重要。低氧是惡性實體腫瘤微環(huán)境的特征之一。細(xì)胞增殖加速導(dǎo)致腫瘤內(nèi)部氧氣缺乏使腫瘤細(xì)胞一直處于低氧壓力之下,同時導(dǎo)致低氧誘導(dǎo)因子1α (Hypoxia-induciblefactor1-alpha,HIF-1α)的失調(diào)和過表達(dá)。作為重要的轉(zhuǎn)錄因子,HIF-1α 一方面調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子,促紅細(xì)胞生成素,以及代謝關(guān)鍵酶等幫助腫瘤細(xì)胞在低氧壓力下生存;另一方面,HIF-1α又能抑制腫瘤細(xì)胞增殖。HIF-1α可通過上調(diào)p53及p27使細(xì)胞停留在G1期。最新研究表明,HIF-1α可與細(xì)胞分裂周期蛋白6 (Cell division cycle 6,Cdc6)結(jié)合,調(diào)控Cdc6和微小染色體維持復(fù)合物(Minichromosome maintenance protein complex,MCM)的形成及MCM的活性,阻止DNA復(fù)制,誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯。在HPV陽性宮頸癌中,由于癌基因E6、E7的存在使得細(xì)胞的低氧應(yīng)答及增殖調(diào)控變得更加復(fù)雜。因此,探究低氧狀態(tài)下HPV陽性宮頸癌細(xì)胞的增殖特點及調(diào)控機(jī)制非常重要。細(xì)胞分裂周期蛋白6 (Cdc6)在真核生物DNA復(fù)制中起到重要作用,其經(jīng)典功能是在細(xì)胞周期G1期參與前復(fù)制復(fù)合體(Pre-replication complex,preRCs)的組裝,起始DNA復(fù)制,使細(xì)胞進(jìn)入S期。當(dāng)Cdc6高表達(dá)時,細(xì)胞又能表現(xiàn)出癌細(xì)胞特征,因此,Cdc6被普遍認(rèn)為與腫瘤惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)。在宮頸組織中,Cdc6在CIN Ⅲ及宮頸癌中高表達(dá),宮頸涂片的Cdc6免疫組化結(jié)果可作為診斷細(xì)胞惡變的標(biāo)記物。近年有文獻(xiàn)報道Cdc6在細(xì)胞周期G1/S期轉(zhuǎn)換中發(fā)揮作用。Cdc6通過釋放與p21,p27結(jié)合的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2 (Cyclin dependent kinase 2, Cdk2)來推動細(xì)胞周期進(jìn)程。我們近期的研究發(fā)現(xiàn),Cdc6的表達(dá)水平在HPV-16 E7表達(dá)細(xì)胞中顯著上調(diào);在血清饑餓等條件下Cdc6在E7細(xì)胞逃避G1檢驗點過程中發(fā)揮作用。這些研究結(jié)果提示,Cdc6參與了 E7蛋白誘導(dǎo)的宿主細(xì)胞周期紊亂。但在低氧狀態(tài)下,Cdc6在宮頸癌發(fā)生過程中的作用及調(diào)控機(jī)制尚未見報道。綜上,本研究提出以下研究目標(biāo):(1)探究低氧下HPV-16 E7表達(dá)細(xì)胞及宮頸癌細(xì)胞的增殖水平變化;(2)探究低氧下Cdc6調(diào)控HPV-16 E7細(xì)胞越過G1期阻滯的作用及機(jī)制。以上研究將有助于闡明HPV致癌新機(jī)制,為發(fā)現(xiàn)宮頸癌治療新靶點提供實驗依據(jù)。研究方法:1. HPV-16 E7表達(dá)細(xì)胞在低氧條件下增殖水平的檢測1.1低氧模型的構(gòu)建:采用三種方法對RPE1 vector和RPE1 E7細(xì)胞進(jìn)行低氧處理,分別是1)將細(xì)胞置于1% O2濃度低氧培養(yǎng)箱8小時;2)采用不同濃度去鐵銨(DFO)模擬低氧;3)采用不同濃度氯化鈷(CoCl2)模擬低氧(但實驗過程中發(fā)現(xiàn)其對DNA有損傷后棄用)。1.2 HPV-16 E7表達(dá)細(xì)胞在低氧條件下細(xì)胞活力檢測:用不同濃度DFO或CoCl2對RPE1 vector和E7細(xì)胞進(jìn)行處理,培養(yǎng)72h后使用細(xì)胞增殖檢測試劑盒(Cell counting kit 8,CCK8)檢測細(xì)胞活力水平。1.3 HPV-16 E7表達(dá)細(xì)胞在低氧條件下增殖水平檢測:將低氧培養(yǎng)箱或低氧模擬藥物處理后的RPE1 vector和E7細(xì)胞用PI染色固定后行流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry),檢測細(xì)胞周期變化;將低氧處理后的細(xì)胞加BrdU標(biāo)記2 h,流式檢測S期細(xì)胞所占比例。2.宮頸癌細(xì)胞中E7蛋白在細(xì)胞低氧抵抗中的作用2.1 siRNA選用策略:在HPV-16中,E6與E7由同一個雙順反子轉(zhuǎn)錄而來,共用同一個啟動子和同一個早期多腺苷酸化位點,單純靶向E7的siRNA(siRNA198)也會同時抑制E6的表達(dá)。因此,本研究采用已報道的siRNA198(siE6E7)來同時沉默E6和E7,siRNA209 (siE6)特異性干擾E6。siE6作為siE6E7的對照干擾來研究E7的功能。2.2低氧下CaSki細(xì)胞中干擾E7檢測細(xì)胞周期變化:在宮頸癌CaSki細(xì)胞中用RNAi干擾HPV-16 E6E7或E6,通過蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot,WB)檢測p53和Rb蛋白、RT-qPCR方法檢測E6、E7mRNA表達(dá)水平,以驗證干擾準(zhǔn)確性和效率。采取1.4所述方法檢測細(xì)胞周期以及S期細(xì)胞差異。3.低氧下E7表達(dá)細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)檢測:RPE1 E7和RPE1 vector細(xì)胞低氧處理后WB檢測HIF-1α,細(xì)胞周期相關(guān)蛋白(Cdk1,Cdk2,Cdk4, Cdk6)及相關(guān)蛋白激酶、激酶抑制蛋白(p53, p21,p27)的變化,同時RT-qPCR檢測關(guān)鍵蛋白mRNA水平變化。4.低氧下HPV-16 E7表達(dá)細(xì)胞差異蛋白的鑒定及Cdc6目標(biāo)蛋白的驗證4.1低氧下E7表達(dá)細(xì)胞與vector細(xì)胞差異蛋白分析:采用非標(biāo)記質(zhì)譜蛋白定量技術(shù)鑒定DFO處理后RPE1 E7和RPE1 vector細(xì)胞的蛋白表達(dá)差異。4.2蛋白聚類分析及目標(biāo)蛋白的驗證:以1.75倍差異作為截點對差異蛋白以進(jìn)行保留。GO分析(GO enrichment analysis)差異蛋白并以生物學(xué)功能進(jìn)行分類。選擇Cdc6為目標(biāo)蛋白,WB驗證其在E7表達(dá)細(xì)胞中的上調(diào)表達(dá),同時行RT-qPCR檢測其mRNA水平變化。5.低氧下Cdc6調(diào)控HPV-16 E7細(xì)胞越過G1期阻滯的作用及機(jī)制研究5.1低氧下Cdc6在E7表達(dá)細(xì)胞低氧抵抗中的作用:RNAi技術(shù)干擾E7細(xì)胞中Cdc6的表達(dá)至vector細(xì)胞水平,WB和RT-qPCR檢測干擾效果及效率。RPE1 E7表達(dá)細(xì)胞轉(zhuǎn)染3 nM siCdc6后行低氧誘導(dǎo)處理,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期;BrdU標(biāo)記實驗檢測細(xì)胞增殖水平。分析低氧下Cdc6表達(dá)與細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)換之間的關(guān)系。5.2低氧下Cdc6調(diào)控E7表達(dá)細(xì)胞越過G1期阻滯的機(jī)制研究:RNAi干擾E7表達(dá)細(xì)胞中Cdc6至vector細(xì)胞水平,WB檢測Cdc6蛋白表達(dá)變化對細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的影響。采用免疫共沉淀技術(shù)(Co-IP)檢測低氧條件下E7表達(dá)細(xì)胞中p21與Cdk1蛋白的結(jié)合水平,siCdc6敲低Cdc6表達(dá)后進(jìn)一步檢測p21與Cdk1的結(jié)合水平,探究Cdc6表達(dá)對兩者結(jié)合能力的影響。研究結(jié)果:1. HPV-16 E7表達(dá)細(xì)胞能越過低氧導(dǎo)致的G1期阻滯:CCK8實驗結(jié)果表明,低氧處理后,雖然RPE1 E7和RPE1 vector細(xì)胞活力均有降低,但與vector細(xì)胞相比E7細(xì)胞活力相對較高,其差異在100～200 μM DFO, 0.4～0.6 mM CoCl2處顯著且具有統(tǒng)計學(xué)意義。細(xì)胞周期檢測結(jié)果表明,雖然在低氧下Vector與E7細(xì)胞均出現(xiàn)了 G1期阻滯,但與vector細(xì)胞相比,E7細(xì)胞G1期細(xì)胞比例較少(為65.1%),而vector細(xì)胞則高達(dá)74.5%。低氧下vector細(xì)胞比E7細(xì)胞表現(xiàn)出更高的阻滯水平,說明E7蛋白的存在能幫助細(xì)胞越過低氧導(dǎo)致的G1期阻滯。BrdU實驗結(jié)果顯示,低氧處理后E7細(xì)胞和vector細(xì)胞中S期比例分別為30.33%和16.15%,差異顯著。低氧下E7細(xì)胞的S期比例顯著高于vector細(xì)胞,說明HPV-16 E7表達(dá)細(xì)胞能夠更多地越過低氧導(dǎo)致的G1阻滯,進(jìn)入DNA復(fù)制的S期。2.低氧下敲低宮頸癌細(xì)胞中E7蛋白表達(dá)導(dǎo)致G1期阻滯:宮頸癌CaSki細(xì)胞含有600多個HPV-16拷貝。在CaSki細(xì)胞中干擾E6E7或E6后,Rb或p53蛋白表達(dá)增加,E6、E7表達(dá)水平降低說明干擾實驗成功。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,在低氧下雖然細(xì)胞均表現(xiàn)出低氧誘導(dǎo)的增殖抑制,但與CaSki-siE6細(xì)胞(G1期比例為65.1%)相比,CaSki-siE6E7細(xì)胞表現(xiàn)出更顯著的G1期阻滯(G1期比例為80.3%),兩組相比差異顯著,說明低氧下敲低E7表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞表現(xiàn)出更多G1期阻滯,進(jìn)一步驗證了低氧下HPV-16 E7能夠幫助宮頸癌細(xì)胞越過G1期檢驗點,促進(jìn)細(xì)胞增殖。BrdU標(biāo)記實驗顯示,低氧下CaSki-siE6E7與CaSki-siE6細(xì)胞中S期比例降低,分別為4.1%與7.8%,兩者有統(tǒng)計學(xué)差異。敲低E7表達(dá)可使宮頸癌細(xì)胞進(jìn)入S期的細(xì)胞比例明顯減少,說明HPV-16 E7促進(jìn)了宮頸癌細(xì)胞低氧下G1/S期轉(zhuǎn)換。3.低氧下HPV-16 E7表達(dá)細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)檢測:RPE1 E7與RPE1 vector細(xì)胞經(jīng)過藥物DFO處理和低氧培養(yǎng)箱處理后WB檢測低氧下相關(guān)細(xì)胞周期蛋白表達(dá)變化,HIF-1α表達(dá)升高說明低氧條件的成功。結(jié)果發(fā)現(xiàn)vector細(xì)胞中p53、p21、p27蛋白水平增高,E7表達(dá)細(xì)胞中三種蛋白表達(dá)水平無較大差異。Cdk1、Cdk2隨著低氧時間增加表達(dá)降低,但在E7表達(dá)細(xì)胞中水平較高。RT-qPCR結(jié)果顯示低氧下Cdk1與Cdk2在E7表達(dá)細(xì)胞中有較高轉(zhuǎn)錄水平。4.低氧下HPV-16 E7細(xì)胞中差異蛋白鑒定及關(guān)鍵蛋白Cdc6的驗證:非標(biāo)記質(zhì)譜蛋白定量技術(shù)分析DFO低氧處理后RPE1 E7和RPE1 vector細(xì)胞的蛋白表達(dá)差異,發(fā)現(xiàn)有182個差異表達(dá)蛋白,其中99個蛋白在E7表達(dá)細(xì)胞中上調(diào),83個蛋白下調(diào)。GO聚類分析顯示差異蛋白生物學(xué)功能分布于大分子復(fù)合物組裝,蛋白翻譯,細(xì)胞極性,損傷修復(fù),氧化還原,DNA復(fù)制等過程。質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn),在低氧條件下E7表達(dá)細(xì)胞中Cdc6蛋白上調(diào)并通過WB驗證。RT-qPCR檢測結(jié)果顯示低氧下E7細(xì)胞中Cdc6轉(zhuǎn)錄水平更高。5. Cdc6促進(jìn)E7表達(dá)細(xì)胞越過低氧導(dǎo)致的G1期阻滯:使用RNAi技術(shù)研究Cdc6是否在E7細(xì)胞低氧抵抗中發(fā)揮作用。部分敲除E7細(xì)胞中Cdc6的表達(dá)使其接近vector中水平,從而保證細(xì)胞周期完整性。流式結(jié)果顯示,低氧下E7-siCdc6組G1期細(xì)胞比例為74.2%,而對照組細(xì)胞僅為63.9%,具有統(tǒng)計學(xué)意義。BrdU標(biāo)記實驗顯示,低氧下,E7-siCdc6組S期比例降低為5.43%,,而E7-siCon組S期比例為19.12%,兩組差異顯著。低氧下干擾Cdc6表達(dá)使E7細(xì)胞進(jìn)入S期細(xì)胞數(shù)量減少。以上結(jié)果證明Cdc6促進(jìn)E7細(xì)胞越過低氧導(dǎo)致的G1期阻滯,而且此作用不依賴于Cdc6的DNA復(fù)制起始功能。6.低氧下Cdc6促進(jìn)p21結(jié)合的Cdk1的釋放:進(jìn)一步探究Cdc6促進(jìn)E7細(xì)胞越過低氧所致G1期阻滯的可能機(jī)制。我們近期研究首次發(fā)現(xiàn),Cdk1可幫助E7細(xì)胞越過DNA損傷所致的G1期阻滯。因此,我們探討了低氧下Cdc6對于E7細(xì)胞中Cdk1表達(dá)的影響。WB結(jié)果顯示,E7表達(dá)細(xì)胞干擾Cdc6后,p53,p21以及Cdk2、Cdk1變化均不明顯,說明Cdc6本身不能直接影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)。進(jìn)一步采用Co-IP實驗檢測干擾Cdc6后E7細(xì)胞中p27與Cdk1的結(jié)合能力。結(jié)果顯示,常氧下與E7-siCon組相比,E7-siCdc6組細(xì)胞內(nèi)p21與Cdk1結(jié)合水平大致不變。但在低氧下,E7-siCdc6組細(xì)胞中與p21結(jié)合的Cdk1比例更高,約為E7-siCon對照組的三倍,差異顯著。干擾Cdc6后E7細(xì)胞中p21與Cdk1的結(jié)合能力增強(qiáng),說明Cdc6在低氧下能促進(jìn)E7細(xì)胞中被p21結(jié)合的Cdk1釋放。較高水平的Cdk1在某種程度上推動了細(xì)胞周期進(jìn)程。研究結(jié)論與意義:1.發(fā)現(xiàn)HPV-16 E7蛋白可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞和E7表達(dá)細(xì)胞越過低氧所致的G1期阻滯,證明低氧條件下E7蛋白可調(diào)控細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)換,促進(jìn)細(xì)胞異常增殖。2.通過質(zhì)譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)低氧下HPV-16 E7表達(dá)細(xì)胞中Cdc6表達(dá)上調(diào)并進(jìn)行了驗證。3.低氧下敲低E7細(xì)胞中Cdc6蛋白表達(dá)至vector細(xì)胞水平,發(fā)現(xiàn)Cdc6可促進(jìn)E7細(xì)胞越過低氧所致G1期阻滯,Cdc6在G1/S期轉(zhuǎn)換過程中必不可少且此作用不依賴于其DNA復(fù)制起始功能。4.機(jī)制研究表明,低氧下Cdc6促進(jìn)E7細(xì)胞釋放p21結(jié)合的Cdk1有助于推動細(xì)胞周期進(jìn)程,導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂。綜上,本研究揭示了 Cdc6調(diào)控宮頸癌細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)換的一個新功能,即在低氧狀態(tài)下,Cdc6參與了 HPV-16E7蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞周期紊亂。此發(fā)現(xiàn)有助于深入闡明HPV E7蛋白的致癌機(jī)制,為發(fā)現(xiàn)宮頸癌治療的新靶點提供實驗依據(jù)。第二部分:新式HPV-16病毒整合位點檢測方法的建立研究目的:口咽鱗狀細(xì)胞癌(Oropharyngeal squamous cell carcinoma,OPSCC)屬于頭頸癌的一種,與人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)感染密切相關(guān),其HPV陽性率高于80%。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查,OPSCC多發(fā)于擁有多個性伴侶,更多口腔性行為的年輕人群。盡管目前頭頸癌全球發(fā)病率有降低趨勢,但口咽癌的發(fā)病率卻顯著升高。因此,深入探究口咽癌的發(fā)病機(jī)制,尋找新的治療靶點和防治方法非常重要。人乳頭瘤病毒是一類小的DNA環(huán)狀病毒,根據(jù)臨床致病程度分可為高危型和低危型,高危型HPV的早期蛋白E6、E7與腫瘤發(fā)生密不可分。除可以降解重要抑癌分子p53和pRb之外,E6、E7還可以與細(xì)胞內(nèi)其他蛋白結(jié)合,激活端粒酶活性,使人原代上皮細(xì)胞永生化等。但E6、E7并不能直接使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化,它們進(jìn)一步誘發(fā)的基因組行為與腫瘤發(fā)生發(fā)展更加密切。HPV的感染和整合加劇了基因組不穩(wěn)定性,E6、E7的存在使抑癌基因,以及病毒整合位點相鄰基因的突變率增高是導(dǎo)致細(xì)胞癌變的關(guān)鍵因素�；蚪M不穩(wěn)定性增強(qiáng)是腫瘤發(fā)展的重要標(biāo)志,其主要形式是多倍體的形成,隨后導(dǎo)致非整倍體細(xì)胞的出現(xiàn)。持續(xù)的高危型HPV感染導(dǎo)致宿主DNA損傷程度增加,通過破壞微管,激活紡錘體組裝檢驗點等行為導(dǎo)致細(xì)胞多倍體形成。因此,全面檢測HPV在口咽癌中的整合位點,分析HPV各基因整合頻率,組合多樣性等,對深入研究HPV對口咽腫瘤發(fā)展機(jī)制以及臨床治療具有重要的指導(dǎo)意義。早期HPV檢測多采用分子生物學(xué)檢測手段,如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction, PCR)等。在假定HPV的整合會導(dǎo)致早期基因E2在宿主染色體中缺失的前提下,通過設(shè)計特異性引物檢測HPV E6, E2的表達(dá)比例來確定當(dāng)前HPV處于游離或整合狀態(tài)。隨著新技術(shù)的出現(xiàn),基于分子雜交的SPF-LiPA,基于核酸的APOT等分析相繼涌現(xiàn),這些技術(shù)可以特異性結(jié)合并部分?jǐn)U增病毒整合位點相鄰片段來得到宿主基因組整合信息。但上述方法在探針設(shè)計上局限性強(qiáng),只能檢測少量HPV類型,不能很好地分析臨床上HPV感染情況,且檢測方法存在偏倚性。近年來,隨著高通量測序技術(shù)(Next generation sequencing,NGS)的迅速發(fā)展,很多基于此技術(shù)的HPV檢測方法被建立起來。2015年,華大基因團(tuán)隊采取全基因組測序方法,在104個人宮頸癌樣本和5株細(xì)胞系中全面地進(jìn)行了 HPV在人類基因組整合位點的研究。此方法覆蓋面廣,偏倚性低,但耗時較長,且花費巨大,在研究模型轉(zhuǎn)換方面并不靈活,不利于技術(shù)的普及以及個體化病人信息的提取和檢測。為解決這些難題,我們創(chuàng)新性地建立了一項基于PCR的DNA高通量測序技術(shù),利用96孔板快速構(gòu)建DNA文庫,通過對HPV基因組的針對性測序發(fā)現(xiàn)HPV在宿主基因組的整合位點。DNA來源除培養(yǎng)細(xì)胞系外,還包括福爾馬林固定,石蠟包埋(Formalin-fixed, paraffin-embedded, FFPE)的口咽癌標(biāo)本。此方法取材小,時間短,靈敏度高,適用廣泛,推廣性強(qiáng),能夠為外源DNA摻入等相關(guān)基礎(chǔ)研究提供良好的檢測方法,為臨床精準(zhǔn)治療提供可靠基礎(chǔ)。研究方法:1 口咽癌FFPE樣本中HPV陽性率的檢測1.1 口咽癌FFPE樣本中提取RNA:實驗所選口咽癌樣本皆為p16免疫組化染色陽性(p16在臨床中常用來預(yù)測HPV陽性的癌癥)。使用基于QIAGEN石蠟切片RNA提取的標(biāo)準(zhǔn)操作方法在免疫組化p16陽性的美國口咽癌患者FFPE標(biāo)本中提取RNA。1.2特異性HPV引物設(shè)計:根據(jù)已發(fā)表文章,使用針對HPV 16型,18型,31型,33型35型,39型,45型,52型,56型,58型,59型,66型與68型早期基因E6,E7特異性引物進(jìn)行HPV篩查。GAPDH和β-actin作為實驗對照。1.3 HPV篩查模板的準(zhǔn)備:在384孔板中,每個樣品分32孔進(jìn)行HPV水平篩查,每板12個樣品。將上述引物用TE buffer稀釋到0.5 μM,每孔5μL。將備好引物的384孔板放到真空抽干機(jī)中處理1小時(直到每孔液體不可見),放入-20℃儲存。1.4實時定量PCR檢測口咽癌FFPE樣本中HPV表達(dá)水平:將石蠟包埋樣品中提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,將cDNA放入已備好的HPV篩查模板中,進(jìn)一步通過RT-qPCR方法檢測樣本中HPV類型及表達(dá)水平。2新式DNA測序技術(shù)的建立以及在口咽癌中檢測HPV整合位點的應(yīng)用2.1 口咽癌FFPE樣本中提取DNA:使用基于QIAGEN石蠟切片DNA提取的標(biāo)準(zhǔn)操作方法在HPV-16陽性美國口咽癌患者FFPE標(biāo)本中提取DNA。2.2基于Illumina測序平臺,針對HPV-16基因組的引物設(shè)計:本技術(shù)采用雙向測序方法,設(shè)計兩個index序列,一個molecular index序列。Adapter部分序列與Illumina測序平臺OligoA相同,通過連接引入到DNA文庫中,OligoB序列通過PCR過程引入。在HPV基因組引物設(shè)計方面,我們用Perl語言編寫程序,在HPV-16型基因組7900多個堿基中,依以下原則進(jìn)行引物設(shè)計:a,長度為21到25個堿基;b,Tm值在61.5℃到63℃之間;c,GC含量在40%到60%之間;d,高復(fù)雜性,無重復(fù)序列;e,無自身互補(bǔ)序列。最終針對HPV正義鏈和反義鏈兩個方向各選擇19個引物,同向引物相隔400左右堿基數(shù),雙向引物每條相隔200左右堿基數(shù),完整、全面地覆蓋HPV-16基因組全長。2.3新式測序方法在口咽癌細(xì)胞系中的實施和優(yōu)化:以HPV-16陽性的宮頸癌細(xì)胞系CaSki作對照,在口咽鱗狀細(xì)胞癌UM-SCC-47 (含有HPV-16型基因組)中建立方法,通過測序進(jìn)行檢測和優(yōu)化。實驗優(yōu)化內(nèi)容主要包括a,初始DNA用量對結(jié)果的影響;b,連接體系的確定;c,兩步法或一步法PCR條件可行性以及對結(jié)果的影響;d,PCR體系及條件的確定。2.4 口咽癌FFPE樣本DNA文庫的構(gòu)建和HPV整合位點的檢測:利用上述口咽癌細(xì)胞系所建立的新式DNA文庫準(zhǔn)備方法和測序方法,將口咽癌樣本DNA根據(jù)index1和index2分組,使用MiSeq進(jìn)行雙向測序,數(shù)據(jù)讀取方式為2 x 250堿基。3測序數(shù)據(jù)的處理與輸出數(shù)據(jù)分析需要經(jīng)過三個部分:原始數(shù)據(jù)的讀取,數(shù)據(jù)處理以及數(shù)據(jù)輸出。使用Perl語言程序書寫三個腳本并獨立運行。3.1原始數(shù)據(jù)地處理:使用腳本一運行程序。主要包括:a,舍棄讀取不完全,或有明顯讀取錯誤的數(shù)據(jù);b,剪掉測序引物序列,剩下目的序列,可分析DNA文庫質(zhì)量和測序質(zhì)量;c,將所讀序列聚類分析。測序時數(shù)據(jù)雖雙向讀取,但每個簇共用同一個名字。因此,聚類分析后可得到每個讀數(shù)上下游信息,中間以10個“L”連接,并進(jìn)行下一步分析。3.2測序數(shù)據(jù)與HPV-16基因組的比對:使用腳本二運行程序。將上述所得數(shù)據(jù)與HPV-16基因組進(jìn)行比對,最小長度限定為30個堿基。為了全面尋找讀數(shù)中HPV-16序列,將每個讀數(shù)以1-30, 2-31,3-32的方式與HPV-16序列進(jìn)行比對,舍棄匹配不足30堿基的序列,輸出文件。3.3 HPV-16陽性的測序數(shù)據(jù)與人基因組序列的比對:使用腳本三運行程序。將上述篩選所得數(shù)據(jù)與每個染色體基因信息進(jìn)行比對,同樣設(shè)定最小限度為30個堿基。將讀數(shù)以1-30, 2-31, 3-32的方式與每條染色體信息逐一比對,舍棄匹配不足30堿基的序列,輸出文件。研究結(jié)果:1. p16陽性口咽癌患者中HPV陽性率高于90%: 口咽癌FFPE樣本提取的RNA質(zhì)量滿足HPV篩選的要求。在135例口咽癌樣本(免疫組化p16陽性)中,通過HPV基因表達(dá)譜(HPV profiling)方法同時篩查13種常見高危型HPV,結(jié)果發(fā)現(xiàn)122例患者HPV陽性(陽性率為90.4%)。其中115例患者為HPV-16型陽性,3例患者為HPV-18型陽性,3例患者為HPV-33型陽性,1例為HPV-59型陽性,HPV陰性患者為13例。蛋白p16表達(dá)與HPV陽性率密切相關(guān)。選擇HPV-16型陽性的患者樣本進(jìn)行下一步測序研究。2. HPV整合位點檢測模型成功建立并在口咽癌患者樣本中應(yīng)用:口咽癌HPV-16陽性的FFPE樣本DNA質(zhì)量滿足Illumina平臺測序的要求。以CaSki為陽性對照,293T細(xì)胞作為陰性對照,在口咽癌細(xì)胞系UM-SCC-47中成功建立起滿足測序條件的DNA文庫,通過測序并以TP63基因舉例展示分析方法。將此實驗?zāi)Ｐ瓦\用到102個HPV-16型陽性的口咽癌樣本中進(jìn)行測序,以樣本0450R_0461F為例展示測序讀取數(shù)據(jù)分析、DNA文庫質(zhì)量分析以及HPV-16整合位點所在宿主基因位置。將本方法與目前靶向測序、全基因組測序技術(shù)作了比較,體現(xiàn)出其方便、快捷的特點,填補(bǔ)了口咽癌患者基因組HPV-16病毒整合研究的空白。研究結(jié)論與意義:1.本研究首次使用HPV基因表達(dá)譜方法同時檢測了 口咽癌患者石蠟包埋樣本中13種常見高危型HPV,發(fā)現(xiàn)所選p16陽性樣本HPV陽性率為90.4%,其中HPV-16型所占比例最高,為所有樣本的85.2%。除此之外,HPV 18型,33型和59型也均有發(fā)現(xiàn)。本方法對臨床口咽癌病人,乃至頭頸癌、宮頸癌病人HPV篩查提供了準(zhǔn)確、有效的手段。2.本研究建立了一個新式HPV-16病毒整合位點的檢測方法。通過在96孔板中快速構(gòu)建DNA文庫,利用Multiplex PCR技術(shù)特異性擴(kuò)增HPV-16全部基因組,進(jìn)行測序并分析口咽癌中HPV病毒整合位點。本方法創(chuàng)新性強(qiáng),耗時短,對樣本質(zhì)量要求寬容,且可應(yīng)用于各種外源基因組整合率和整合位點的檢測。對口咽癌病人,乃至其他病人的臨床治療提供了技術(shù)和理論支持。綜上,本研究建立了一個新式基于PCR的HPV-16病毒整合位點檢測方法。進(jìn)一步研究將深入分析HPV-16在口咽癌患者基因組中的整合幾率及整合特點,以及比較HPV感染在宮頸癌和口咽癌中的異同,通過詳細(xì)研究被整合基因的生物學(xué)功能深入挖掘HPV導(dǎo)致口咽癌發(fā)生發(fā)展的更多線索。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R373
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本文編號：1300600