發(fā)布時(shí)間：2017-12-17 15:01

  本文關(guān)鍵詞：磷酸二酯酶-4抑制劑ROF通過(guò)自噬介導(dǎo)對(duì)BV-2細(xì)胞NLRP3炎性小體活化的抑制作用

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【摘要】：目的:前期實(shí)驗(yàn)證明,敲低或抑制磷酸二酯酶-4(phosphodiesterase-4,PDE4)能抑制腦內(nèi)炎癥反應(yīng),但是機(jī)制尚未完全清楚。最近幾年有報(bào)道cAMP能誘導(dǎo)自噬,另一方面,研究發(fā)現(xiàn)自噬活動(dòng)調(diào)控炎癥反應(yīng),而抑制自噬能使炎癥反應(yīng)失控。新型PDE4抑制劑羅氟普蘭(Roflupram,ROF)能提高cAMP水平和抑制炎癥,但是ROF能否能通過(guò)提高cAMP水平誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞自噬并通過(guò)誘導(dǎo)自噬發(fā)揮抗炎作用仍待探討。方法:(1)使用MTT法檢測(cè)不同濃度ROF對(duì)正常及活化的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞生存率的影響;(2)Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白、NLRP3炎性小體通路相關(guān)蛋白、凋亡相關(guān)蛋白、突觸相關(guān)蛋白水平的變化;(3)AO、LYT染色標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)酸性囊泡;(4)LC3免疫熒光檢測(cè)自噬水平變化;(5)使用藥理學(xué)自噬抑制劑3-MA及基因組學(xué)siRNA ATG7轉(zhuǎn)染抑制自噬;(6)采用CQ檢測(cè)自噬潮;(7)ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子;(8)Hoechst染色和相差顯微鏡檢測(cè)凋亡N2a細(xì)胞及存活細(xì)胞突觸變化;(9)條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)系統(tǒng)評(píng)價(jià)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎性微環(huán)境對(duì)N2a的損害及PDE4抑制劑ROF的保護(hù)作用。結(jié)果:(1)MTT的結(jié)果顯示,ROF在0.625-20μM的濃度范圍內(nèi)不對(duì)正常BV-2細(xì)胞的活力產(chǎn)生影響,ROF(10 μM)與LPS+ATP及Aβ25-35刺激的BV-2細(xì)胞有良好相容性。(2)Western blot結(jié)果顯示,與溶劑對(duì)照組相比,ROF增加BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的LC3-Ⅱ蛋白水平且呈劑量依賴性(2.5-10 μM)和時(shí)間依賴性(2-8h),p62的改變與LC3-μ的改變呈負(fù)相關(guān);自噬潮檢測(cè)顯示,與溶劑對(duì)照組相比,CQ(20M)處理后,BV-2細(xì)胞LC3-Ⅱ蛋白水平升高,而ROF(5μM)與CQ(20 μM)聯(lián)用后,LC3-Ⅱ蛋白水平顯著升高,比單獨(dú)CQ組的LC3-Ⅱ水平更高。另外,ROF在AO及LYT染色中都使BV-2細(xì)胞酸性囊泡熒光增加;自噬抑制劑3-MA(1 mM)能逆轉(zhuǎn)ROF的作用。這些結(jié)果顯示ROF誘導(dǎo)了 BV-2細(xì)胞自噬;雷帕霉素、咯利普蘭和毛喉素在AO和LYT染色中的顯示的變化與ROF相似,提示cAMP信號(hào)通路可能參與其自噬的誘導(dǎo)。(3)相差顯微鏡結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,LPS(1μg/ml)+ATP(1 mM)或Aβ25-35(5 μM)在刺激6 h后明顯激活BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞,另一方面,Western blot結(jié)果顯示,被激活BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞在功能上發(fā)生相應(yīng)的改變,包括自噬誘導(dǎo)和NLRP3炎性小體通路活化,表現(xiàn)為自噬標(biāo)記物L(fēng)C3-Ⅱ增加和NLRP3炎性小體通路活化相關(guān)蛋白IL-1β p17、Caspase-1 p10和NLRP3水平的增加。(4)ELISA結(jié)果顯示,與溶劑對(duì)照組相比,ROF對(duì)細(xì)胞釋放IL-1β無(wú)明顯影響,但在聯(lián)合LPS+ATP或Aβ25-35處理BV-2細(xì)胞后,劑量依賴性減少NLRP3炎性小體通路的細(xì)胞因子產(chǎn)物IL-1β的釋放,而且Western blot結(jié)果顯示,與LPS+ATP或Aβ25-35組相比,ROF增加活化BV-2細(xì)胞LC3-Ⅱ,同時(shí)減少其IL-1βp17和Caspase-1 p10,該作用能被自噬抑制劑3-MA逆轉(zhuǎn),表明ROF誘導(dǎo)活化的BV-2細(xì)胞自噬,同時(shí)抑制LPS+ATP和Aβ25-35對(duì)活化BV-2細(xì)胞NLRP3炎性小體通路的激活,該作用與其自噬誘導(dǎo)作用有關(guān);另外,與LPS+ATP和Aβ25-35組相比,ROF與LPS+ATP或Aβ25-35組共培養(yǎng)使BV-2細(xì)胞內(nèi)的pro-IL-1β和NLRP3減少,提示ROF的自噬介導(dǎo)的抗炎作用與自噬性降解pro-IL-1β和NLRP3有關(guān)。(5)在進(jìn)一步研究小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥對(duì)神經(jīng)元的毒性作用實(shí)驗(yàn)中,收集不同方法處理的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基,用于培養(yǎng)N2a神經(jīng)元細(xì)胞24h。Hoechst結(jié)合相差顯微鏡結(jié)果顯示,LPS+ATP和Aβ25-35處理BV-2細(xì)胞的條件培養(yǎng)基增加N2a細(xì)胞凋亡和神經(jīng)損傷,ROF在一定程度上能間接改善該損傷,而該作用能被3-MA逆轉(zhuǎn);Western blot檢測(cè)進(jìn)一步驗(yàn)證了形態(tài)學(xué)結(jié)果,表現(xiàn)為L(zhǎng)PS+ATP和Aβ25-35處理BV-2細(xì)胞的條件培養(yǎng)基升高N2a細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和突觸相關(guān)蛋白PSD95水平,ROF在一定程度上抑制其升高,而該作用能被siRNA ATG7逆轉(zhuǎn),提示ROF自噬介導(dǎo)的抗炎作用能在一定程度上減輕BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)對(duì)N2a細(xì)胞的毒性。結(jié)論:(1)PDE4抑制劑ROF能誘導(dǎo)正常及活化的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞自噬,該作用可能與cAMP信號(hào)通路有關(guān)。(2)NLRP3炎性小體特異性激活劑LPS+ATP和Aβ25-35能激活BV-2細(xì)胞及其NLRP3炎性小體通路(刺激6 h),而ROF能減輕它們的激活作用,ROF該作用與其誘導(dǎo)自噬、自噬性降解NLRP3炎性小體成分NLRP3和pro-IL-1 β有關(guān)。(3)LPS+ATP和Aβ25-35激活NLRP3炎性小體通路和BV-2細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥損傷N2a神經(jīng)元,ROF通過(guò)自噬介導(dǎo)抑制BV-2細(xì)胞NLRP3炎性小體通路活化的作用,間接減少N2a神經(jīng)元細(xì)胞的損傷。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R96

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本文編號(hào)：1300513