本文關(guān)鍵詞：MiR-17調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為類腸道干細(xì)胞及其對實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的影響

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【摘要】：背景和目的潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)為炎癥性腸病(inflammatory bowel diseases,IBD)的一種主要疾病類型,好發(fā)于青壯年,且容易反復(fù)發(fā)作,嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量。目前已有的藥物主要作用為控制腸道炎癥活動和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫,并不能達(dá)到粘膜愈合的效果。而粘膜愈合是治療該疾病的根本目標(biāo)。腸粘膜的修復(fù)始于腸道干細(xì)胞(ISCs)的分化與增殖,近年來用干細(xì)胞移植治療IBD已經(jīng)顯現(xiàn)出一定的效果。但是腸道干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)技術(shù)復(fù)雜,不利于被廣泛推廣使用。骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)因其取材方便且具有多向分化潛能而備受關(guān)注。但是如何將BM-MSCs在體外擴(kuò)增分化為腸道干細(xì)胞并有效送達(dá)受損腸段,以及相關(guān)機(jī)制均有待于探索�；谙嚓P(guān)文獻(xiàn)閱讀,本研究擬在體外應(yīng)用生長因子和miR-17,實(shí)現(xiàn)BM-MSCs →內(nèi)胚層細(xì)胞→腸干細(xì)胞逐步分化,然后將GFP標(biāo)記的類腸道干細(xì)胞,通過保留灌腸移植治療實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎,觀察其歸巢定植以及對腸道炎癥的改善和粘膜修復(fù)的效果。第一節(jié)逐步誘導(dǎo)BM-MSCs分化為類腸道上皮干細(xì)胞目的:建立體外培養(yǎng)體系,將BM-MSCs逐步誘導(dǎo)為類腸道干細(xì)胞方法:提取骨髓間充質(zhì)細(xì)胞,傳至第三代,接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,加入不同濃度的Activin A(0,1,5,10,20,100ng/mL),培養(yǎng)5天,檢測內(nèi)胚層特異性基因Foxa2和Sox17表達(dá)變化,進(jìn)而得出最優(yōu)的Activin A濃度。然后加入最優(yōu)濃度的Activin A,重復(fù)上述5天的培養(yǎng),加入250ng/mLFGF2,培養(yǎng)4天,檢測腸道干細(xì)胞特異性基因Lgr5和Musashi-1的表達(dá)量。結(jié)果:qRT-PCR,WB證實(shí)Activin濃度在5ng§/mL時(shí),Sox和Foxa2表達(dá)量均最高。Activin A誘導(dǎo)5天后,Sox17和Foxa2的表達(dá)量顯著上升。FGF2處理后,qRT-PCR和WB證實(shí)Lgr5和Musashi-1的表達(dá)量逐步上升,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。流式細(xì)胞儀分析表明Lgr5+的細(xì)胞比例為30.06%。結(jié)論:BM-MSCs可在Activin A和FGF2作用下,先轉(zhuǎn)變?yōu)镕oxa2+和Sox17+的內(nèi)胚層細(xì)胞,進(jìn)而再轉(zhuǎn)變?yōu)長gr5+和Musashi-1+的類腸道干細(xì)胞。第二節(jié)miR-17協(xié)同生長因子促進(jìn)BM-MSCs向類腸道干細(xì)胞分化目的:闡述miR-17在BM-MSCs向類腸道干細(xì)胞分化過程中的作用及相關(guān)機(jī)制方法:BM-MSCs按第一部分所述,在5ng/mL Activin A誘導(dǎo)為內(nèi)胚層細(xì)胞,先成功轉(zhuǎn)染miR-17,然后協(xié)同250ng/mLFGF2,誘導(dǎo)4天,檢測Lgr5、Musashi-1和靶基因E2F1和WIFI以及β-catenin的表達(dá)量。免疫熒光和流式細(xì)胞儀進(jìn)一步檢測類腸道干細(xì)胞的表達(dá)比例,最后利用EGF誘導(dǎo)類腸道干細(xì)胞,觀察其在體外是否可以分化為腸上皮細(xì)胞系。結(jié)果:miR-17可以抑制WIF1和E2F1的表達(dá),增強(qiáng)Wnt/β-catenin通路的活性,進(jìn)而顯著提高誘導(dǎo)效率,不僅目的基因Lgr5和Musashi-1表達(dá)量上升,而且誘導(dǎo)時(shí)間縮短至2天,Lgr5+細(xì)胞比例為89.14%。類腸道干細(xì)胞在EGF作用下可繼續(xù)分化為類腸上皮吸收細(xì)胞。結(jié)論:miR-17具有促進(jìn)內(nèi)胚層細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)轭惸c道干細(xì)胞的作用,且其中的機(jī)制與激活Wnt/β-catenin通路活性有關(guān)。第三節(jié)觀察GFP轉(zhuǎn)基因的類腸道干細(xì)胞移植對DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的療效目的:證明體外誘導(dǎo)分化的類腸道干細(xì)胞能夠參與修復(fù)受損的腸粘膜方法:前期急性腸炎模型預(yù)實(shí)驗(yàn)表明3%DSS溶液成模效果最佳。30只6周齡的雄性C57BL/6小鼠,隨機(jī)分為三組,分別為A(Control)組,B(DSS+PBS)組,C(DSS+ISCs)組。B和C兩組小鼠自由飲用3%DSS溶液7天,分別于第7,9天通過保留灌腸注入1 × 106/150ul的細(xì)胞懸浮液和等量的PBS溶液。實(shí)驗(yàn)第14天,每組各處死5只小鼠,取腸組織做病理切片和冰凍切片,免疫熒光檢測移植細(xì)胞定位。qRT-PCR和CBA法測腸組織和血清的炎性因子水平。一個(gè)月后,處理剩余小鼠,免疫熒光觀察腸上皮細(xì)胞Muc2和CK-18表達(dá)。結(jié)果:在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期中,C組小鼠和B組相比較,體重減輕程度更小,恢復(fù)更快,未出現(xiàn)死亡小鼠,病理切片表明結(jié)腸受損程度更小,腸組織和全身炎癥水平更低。免疫熒光檢測可以觀察到GFP細(xì)胞主要定植在腸道中下段,且干細(xì)胞具有歸巢效應(yīng),可以定植在隱窩和腸上皮處,一個(gè)月后可分化為腸上皮細(xì)胞。結(jié)論:體外誘導(dǎo)分化的類腸道干細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠腸道內(nèi)定植,可以歸巢到腸道損傷部位,修復(fù)受損腸組織,減輕腸道和全身炎癥反應(yīng)。結(jié)論1.BM-MSCs可在Activin A和FGF2作用下轉(zhuǎn)變?yōu)轭惸c道干細(xì)胞;2.miR-17通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)BM-MSCs轉(zhuǎn)變?yōu)轭惸c道干細(xì)胞3.體外誘導(dǎo)分化的類腸道干細(xì)胞可定植在受損的腸粘膜,改善腸道的炎癥狀態(tài)。
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R574.62

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

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本文編號：1300306