本文關(guān)鍵詞：黑骨藤抗炎作用及質(zhì)量控制研究

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【摘要】：黑骨藤藥材屬于蘿呮科植物中杠柳屬——黑龍骨Periploca forrestii Schltr.的干燥根或全株,民間廣為流傳的優(yōu)質(zhì)中藥材。主要功效為通經(jīng)、活血、解毒、祛風(fēng),常用于治療跌打損傷、風(fēng)濕、關(guān)節(jié)痛、月經(jīng)不調(diào)等病癥,以其為主藥的上市品種黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊、楓荷除痹酊、復(fù)方仙靈風(fēng)濕酒、生龍驅(qū)風(fēng)藥酒等,在臨床上發(fā)揮了較好的治療作用。黑骨藤主要的化學(xué)成分包括甾體苷、強(qiáng)心苷、低聚糖、香豆素、黃酮、三萜類,藥理實(shí)驗(yàn)證明其具有抗癌、抗炎、鎮(zhèn)痛、強(qiáng)心、免疫抑制及抗氧化等作用,但其抗炎的有效組分及作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。且該藥材現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中僅記載了其性狀和理化鑒別,這在一定程度上限制了黑骨藤藥材的應(yīng)用,同時(shí)也說(shuō)明黑骨藤藥材在質(zhì)量控制方面有待完善�；诖�,本研究對(duì)黑骨藤抗炎有效組分進(jìn)行篩選、體內(nèi)抗炎作用、作用機(jī)制、化學(xué)成分分析以及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了研究,為闡明黑骨藤的抗炎作用機(jī)理提供了理論基礎(chǔ),為藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂與臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。1.采用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞體外炎癥模型,對(duì)黑骨藤水組分(WFPF)、10%乙醇組分(EFPF)、50%乙醇組分(50%EFPF)、95%乙醇組分(95%EFPF)進(jìn)行抗炎活性篩選,明確其抗炎的有效組分。采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率、Griess試劑法檢測(cè)細(xì)胞上清液中一氧化氮(NO)含量、酶聯(lián)免疫法(ELISA)法檢測(cè)細(xì)胞上清液中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的含量,考察了黑骨藤不同組分的抗炎活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示黑骨藤中EFPF抑制LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞釋放NO和TNF-α的作用較優(yōu),表明EFPF為黑骨藤抗炎的有效組分。2.采用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-Q-TOF-MS)聯(lián)用的技術(shù)對(duì)黑骨藤抗炎有效組分EFPF中的主要化學(xué)成分進(jìn)行表征,通過(guò)對(duì)各色譜峰的保留時(shí)間、分子量、分子式、紫外吸收、二級(jí)質(zhì)譜等信息進(jìn)行分析,并結(jié)合對(duì)照品和文獻(xiàn)比對(duì),對(duì)有效組分中的8個(gè)主要化學(xué)成分峰進(jìn)行了表征�；瘜W(xué)成分分析表明,EFPF中主要含有1-O-咖啡�；鼘幩�(1-CQA)、3-O-咖啡酰基奎寧酸(3-CQA)、5-O-咖啡�；鼘幩�、4-O-咖啡酰基奎寧酸、9-O-咖啡�；鼘幩帷�1-O-咖啡�；鼘幩嵋阴�、3-O-咖啡�；鼘幩嵋阴�、4-O-咖啡�；鼘幩嵋阴�(4-CDOA)等各種咖啡�；鼘幩犷惢衔�,為進(jìn)一步闡釋其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了依據(jù)。3.采用醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高、二甲苯致小鼠耳腫脹和角叉菜膠致大鼠足趾腫脹的動(dòng)物體內(nèi)炎癥模型,對(duì)篩選得到的黑骨藤抗炎有效組分EFPF進(jìn)行了體內(nèi)抗炎藥效研究。結(jié)果顯示,EFPF能顯著降低小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性、二甲苯誘導(dǎo)的小鼠耳廓腫脹和角叉菜膠誘導(dǎo)的大鼠足趾腫脹。提示EFPF具有較好的體內(nèi)抗炎活性。4.進(jìn)一步研究EFPF對(duì)RAW 264.7細(xì)胞凋亡、炎癥介質(zhì)和炎癥因子分泌、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和環(huán)氧合酶2(COX-2)等相關(guān)調(diào)控蛋白表達(dá)的影響以及核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信號(hào)通路的情況,探討EFPF的抗炎作用機(jī)制。采用AO/EB染色法和流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)EFPF對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞形態(tài)變化、凋亡率、活性氧(ROS)和線粒體膜電位(MMP)影響;采用Griess試劑法測(cè)定RAW 264.7細(xì)胞中NO的含量;采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中前列腺素E2(PGE2)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素6(IL-6)和白介素10(IL-10)的分泌水平;應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)(RT-PCR)測(cè)定RAW264.7分泌細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6、IL-10)mRNA表達(dá)的情況;采用免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)iNOS和COX-2蛋白表達(dá)以及NF-κB、MAPKs(細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶-ERK、C-jun氨其未端激酶-JNK、p38絲裂原活化蛋白激酶-p38 MAPK)信號(hào)通路相關(guān)調(diào)控蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與LPS模型組相比,EFPF劑量顯著降低LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞凋亡率、ROS的含量和MMP(P0.05,P0.005,P0.001);顯著抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中炎癥介質(zhì)NO、PGE2(P0.05)和炎癥因子TNF-α、IL-6的分泌(P0.05),增加IL-10的產(chǎn)生(P0.05);顯著抑制TNF-a、IL-6和提高IL-10的mRNA表達(dá)量(P0.005,P0.001);顯著抑制細(xì)胞中i NOS和COX-2的蛋白表達(dá)(P0.05,P0.001),降低NF-κB信號(hào)通路中p-IκBα和p65蛋白的表達(dá)(P0.05,P0.001),抑制IκBα蛋白降解(P0.05,P0.001);并抑制MAPKs信號(hào)通路中p38、ERK1/2和JNK的磷酸化(P0.05,P0.005)。結(jié)果表明EFPF主要通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡,ROS的過(guò)量產(chǎn)生及穩(wěn)定MMP、調(diào)控NF-κB和MAPKs信號(hào)通路來(lái)降低TNF-α,IL-6,NO和PGE2等炎癥因子的產(chǎn)生以及抑制i NOS和COX-2蛋白表達(dá),從而發(fā)揮EFPF的抗炎作用。5.通過(guò)對(duì)不同產(chǎn)地黑骨藤藥材總咖啡酸酯含量、多指標(biāo)含量測(cè)定及指紋圖譜的研究,建立了紫外-可見光分光光度測(cè)定藥材中總咖啡酸酯含量和超高效液相色譜法測(cè)定多指標(biāo)成分定量控制方法,并對(duì)指紋圖譜進(jìn)行了研究,同時(shí)進(jìn)行了水分、總灰分、酸不溶性灰分及有機(jī)氯農(nóng)藥殘留等相關(guān)項(xiàng)目的檢查,完善了黑骨藤藥材的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn),為黑骨藤藥材的開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)及理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285;R284

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