本文關(guān)鍵詞：組織工程血管種子細(xì)胞和脫細(xì)胞支架的篩選及功能研究

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【摘要】：[目的]考慮到圍產(chǎn)期間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell,MSC)的生物學(xué)特性和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)生物支架的優(yōu)勢(shì),本研究探索臍帶華通式膠間充質(zhì)干細(xì)胞(Wharton's jelly mesenchymal stem cell,WJ-MSC)和羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(amniotic membrane mesenchymal stem cell,AM-MSC)作為組織工程血管(tissue engineering blood vessel,TEBV)種子細(xì)胞的可行性,脫細(xì)胞制備豬頸動(dòng)脈ECM支架并評(píng)估其理化特性。獲得種子細(xì)胞和ECM支架,體外構(gòu)建TEBV并植入體內(nèi),初步評(píng)估其功能。[方法]應(yīng)用組織塊貼壁法分離WJ-MSC和AM-MSC,從形態(tài)學(xué)、免疫表型和多向分化潛能等方面對(duì)其進(jìn)行鑒定。基于MTT和成纖維細(xì)胞集落形成評(píng)估,分析WJ-MSC和AM-MSC的增殖能力和自我更新性能。通過(guò)血小板粘附評(píng)估、測(cè)定凝血酶原時(shí)間(prothrombin time,PT)和部分凝血酶活化時(shí)間(activated partial thromboplastin time,APTT)探索WJ-MSC和AM-MSC的血液相容性分析。基于細(xì)胞膜片技術(shù),從組織學(xué)、電鏡觀察、生化分析、PCR和Live/Dead評(píng)估,比較WJ-MSC和AM-MSC在膜片形成過(guò)程中合成細(xì)胞外基質(zhì)的性能和細(xì)胞活力,探索更適用于構(gòu)建TEBV的MSC。獲取新鮮豬頸動(dòng)脈并隨機(jī)分為5組(n=6),基于十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、脫氧膽酸鈉(sodium deoxycholate,SDC)和曲拉通 X-100(TritonX-100,Tri),分別應(yīng)用 1%(m/v)SDS+1%(m/v)SDC(B組),0.5%(m/v)SDS+0.5%(m/v)SDC(C組),1%(m/v)SDS+1%(v/v)Tri(D組)和0.5%(m/v)SDS+0.5%(v/v)Tri)(E組)4種方案進(jìn)行脫細(xì)胞處理,未脫細(xì)胞處理的豬頸動(dòng)脈(A組),應(yīng)用HE染色、五色套染、掃描電鏡、免疫組化、DNA和細(xì)胞外基質(zhì)定量等方法評(píng)價(jià)ECM支架,進(jìn)一步測(cè)定生物力學(xué)性能(人大隱靜脈做質(zhì)控)。綜合分析ECM支架,獲得豬頸動(dòng)脈ECM支架的最適制備方法,應(yīng)用1%(SDS+SDC)的脫細(xì)胞方案制備豬頸動(dòng)脈ECM支架,種植WJ-MSC構(gòu)建TEBV,HE染色觀察TEBV,建立兔腹主動(dòng)脈間位移植模型,應(yīng)用多普勒超聲和HE染色初步評(píng)估TEBV的生理功能。[結(jié)果]基于外植體的方法,本研究成功分離獲得成纖維細(xì)胞樣的WJ-MSC和AM-MSC。與AM-MSC比較,WJ-MSC的增殖能力和自我更新能力更強(qiáng),具備抗血小板粘附特性,血液相容性更好,此外,在體外培養(yǎng)構(gòu)建細(xì)胞膜片的過(guò)程中,WJ-MSC合成膠原的能力更強(qiáng),且細(xì)胞活性更佳。四種脫細(xì)胞方案中,B組和C組能完全去除細(xì)胞,而D組和E組于局部可見(jiàn)細(xì)胞殘留,DNA定量分析結(jié)果顯示,B組ECM支架內(nèi)殘存的DNA成分最少。脫細(xì)胞導(dǎo)致不定形細(xì)胞外基質(zhì)成分破壞并去除部分異種抗原α-1,3-Gal,膠原纖維束和彈性蛋白保存完整,B組ECM支架的多孔結(jié)構(gòu)在形態(tài)和尺寸方面優(yōu)于其余組。脫細(xì)胞導(dǎo)致長(zhǎng)軸最大應(yīng)力、長(zhǎng)軸Young's模量、爆破壓力、縫線(xiàn)保持力和縫合保留強(qiáng)度下降,然而,對(duì)ECM支架的順應(yīng)性無(wú)明顯影響。去除平滑肌細(xì)胞是導(dǎo)致豬頸動(dòng)脈ECM支架生物力學(xué)性能改變的主要原因。應(yīng)用1%(SDS+SDC)方案制備豬頸動(dòng)脈ECM支架,種植WJ-MSC可構(gòu)建TEBV,然而,HE染色顯示細(xì)胞種植效率不高,TEBV體內(nèi)植入后其生理功能有限。[結(jié)論]作為構(gòu)建TEBV的種子細(xì)胞,WJ-MSC優(yōu)于AM-MSC,WJ-MSC有望替代內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。應(yīng)用1%(SDS+SDC)的脫細(xì)胞方法能獲得更適合的豬頸動(dòng)脈ECM支架。基于豬頸動(dòng)脈ECM支架種植WJ-MSC,體外培養(yǎng)可獲得具備一定生理功能的TEBV。
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R318.08;R654

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 蒲磊;吳劍;孟明耀;倪海燕;葉飛;李亞雄;蔣立虹;;不同脫細(xì)胞方案制備主動(dòng)脈細(xì)胞外基質(zhì)支架的比較研究[J];中國(guó)修復(fù)重建外科雜志;2014年11期

2 員海超;蒲春曉;魏強(qiáng);韓平;;組織工程細(xì)胞外基質(zhì)材料研究進(jìn)展[J];中國(guó)修復(fù)重建外科雜志;2012年10期

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本文編號(hào)：1298393