發(fā)布時間：2017-12-16 10:15

  本文關(guān)鍵詞：染色體改變、AZF缺失與CDK2基因在非梗阻性無精癥中的研究

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【摘要】：第一部分染色體改變、AZF缺失在非梗阻性無精癥中的研究研究目的:探討染色體核型改變與Y染色體微缺失(Y chromosome microdeletions of azoospermia factor,AZF)在中國男性非梗阻性無精子癥患者(non-obstructive azoospermia,NOA)不同病理類型中分布比例,同時研究染色體核型改變、AZF缺失與正常組間生殖內(nèi)分泌激素、睪丸體積及精子獲取率的關(guān)系,并為這些男性不育患者提供可靠的遺傳學(xué)咨詢。研究方法:本研究為病例對照研究,其中病例組包括286例睪丸活檢的NOA,對照組為正常生育男性100例。首先將接受睪丸活檢的286例NOA患者的睪丸活檢組織用Bouin氏液,固定24小時,經(jīng)過取材、脫水、包埋、石蠟切片及蘇木素-伊紅染色后鏡檢后進(jìn)行病理分型,分型的依據(jù)為有無精子及精子發(fā)生過程的阻滯階段。同時,對不同病理類型的標(biāo)本進(jìn)行電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察NOA不同病理類型的生精上皮、支持細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞的變化。染色體核型分析通過提取外周血后進(jìn)行培養(yǎng),秋水仙素處理使細(xì)胞分裂停在中期并收取分裂相,通過沉淀、低滲、(預(yù))固定等收獲細(xì)胞,制片并鏡檢,通過染色體G顯帶技術(shù)分析至少20個分裂相。對286例NOA患者的AZF四個區(qū)域AZFa、AZFb、AZFc與AZFd(位于AZFb與AZFc之間)缺失進(jìn)行分析時,使用標(biāo)準(zhǔn)操作流程抽取患者外周血并提取DNA后進(jìn)行11個STS位點的聚合酶連反應(yīng)(Polymerase chain reaction,PCR),采用正常男性和女性,分別作為陰/陽性對照,PCR反應(yīng)后經(jīng)1%瓊脂糖加入1x TAE緩沖液并加入genecolourⅡ,室溫100V,40min凝膠電泳。最后進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,分析不同病理類型間的染色體的核型改變及AZF缺失類型,然后對不同病理類型間、染色體組與正常組之間、AZF缺失與正常組間在不同病理類型中的臨床指標(biāo)變化進(jìn)行分析,如生殖內(nèi)分泌激素的卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)、黃體生成素(luteinizing hormone,LH)、睪酮(testosterone,T)、精子獲取率(sperm retrival,SR)及睪丸體積等。研究結(jié)果:在本研究中通過鏡檢形態(tài)學(xué)分析,286例無精子癥的患者中,包括有精子形成,但是各種生精細(xì)胞都存在數(shù)量減少伴發(fā)生精細(xì)胞紊亂的生精功能低下組(Hypospermatogenesis,HS)39例;無精子生成,生精阻滯在不同階段的生精功能阻滯型(germ cell mature arrest,MA)48例;完全無精子發(fā)生,曲細(xì)精管中只有支持細(xì)胞的唯支持細(xì)胞綜合征(Sertoli cell only syndromegerm,SCOS)199例。并通過電鏡分析各種不同的病理類型均出現(xiàn)不同程度的生精上皮、支持細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞的改變,尤其是在生精功能最差的SCOS組中,電鏡下可見曲細(xì)精管膠原纖維組織增生,支持細(xì)胞增生,胞漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富,線粒體嵴消失伴發(fā)空泡變,并出現(xiàn)較多自噬體。在286例NOA患者中有14.30%的患者出現(xiàn)染色體改變。其中染色體異常8例(MA2例,SCOS 6例),包括常染色體改變有2例(MA 1例,SCOS1例),性染色體改變患者有6例(包括SCOS組4例克氏綜合征(47,XXY)和2例嵌合體(MA 1例,SCOS 1例))。染色體多態(tài)發(fā)生在對照組的比例是30%,而發(fā)生在NOA組的比例為11.5%。在不同病理類型組中,SCOS組:6例伴有染色體核型改變(其中包括1例常染色體異常和5例性染色體異常(以克氏綜合征為主);染色體多態(tài)性改變的有26例,其中以Y染色體的多態(tài)為主(6例為Yqh-)。MA組:7例(14.6%)伴有染色體改變(其中1例為常染色體異常,1例為性染色異常及5例染色體多態(tài)改變,且以Y染色體多態(tài)改變?yōu)橹?。HS組:有2例(5.1%)伴有染色體改變,且均為Y染色體多態(tài)性改變。染色體核型改變在HS,MA及SCOS三組內(nèi)無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.213)。45例(15.7%)NOA患者發(fā)生AZF缺失,其中最常見的缺失類型為AZF(c+d)。在不同病理類型中,SCOS組:24例AZF缺失(24/199,12.1%),其中2例AZFa缺失,1例AZFc缺失,1例AZFd缺失,9例AZF(c+d)缺失,11例AZF(b+c+d)缺失(為主要缺失類型);MA組:19例 Z 缺失(19/48,39.6%),其中1例 缺失,4例 AZFc缺失,2例AZF(b+c)缺失,1例AZF(b+d)缺失,7例AZF(c+d)缺失(最主要缺失類型),4例AZF(b+c+d)大片段缺失;HS組:2例AZF缺失(2/39,5.1%),均為AZF(c+d)缺失,三組之間有顯著性差異(x 2=25.926,P0.001)。同時本研究中發(fā)現(xiàn)AZF缺失伴發(fā)染色體核型改變有14例(3.6%)(SCOS組有10例,MA組有4例)。以AZF(b+c+d)大片段缺失聯(lián)合染色體改變多見(最常見于SCOS組中)。精子獲取率(Sperm retrieval,SR)在不同病理類型間有明顯差異(P0.001)。SR在HS比例明顯高于其他兩組病理類型;而SR在染色體異常組與正常組,及AZF缺失組與正常組的組間均無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論及意義:本研究首次對細(xì)胞遺傳學(xué)因素(染色體核型和AZF缺失)在經(jīng)睪丸活檢的NOA不同病理類型中的分布進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)在NOA患者中,尤其是在生精功能較差的SCOS中,細(xì)胞遺傳學(xué)改變比例較高,通過染色核型改變及AZF缺失分析研究可以更好地了解男性不育的不同病理類型的細(xì)胞遺傳學(xué)病因?qū)W并給予上述患者可靠的遺傳學(xué)咨詢,為伴有染色體核型改變或者AZF缺失的患者選擇合適的輔助生殖技術(shù),并避免輔助生殖技術(shù)引起遺傳學(xué)的垂直傳播。第二部分CDK2基因在特發(fā)性非梗阻性無精癥中的研究實驗?zāi)康?無精子癥占男性不育的10%?20%,其中約40%生精功能障礙病因未知,又被稱作特發(fā)性無精子癥。研究證實,男性不育是具有遺傳基礎(chǔ)的復(fù)雜疾病,基因異�？砂l(fā)生在男性不育各個階段,而減數(shù)分裂是正常精子生成過程的重要環(huán)節(jié),過程受到許多基因精密調(diào)控,細(xì)胞依賴蛋白酶2(Cyclin dependent kinase 2,CD2)基因表達(dá)于精母細(xì)胞減數(shù)分裂的全過程,且在小鼠動物模型中證實缺失能夠引起雄性小鼠不育,但是目前國內(nèi)外尚無CDK2基因在男性無精子癥人群方面的研究。本研究旨在探討中國漢族不明原因NOA病理類型是否與CDK2基因突變相關(guān)。實驗方法:本研究選取特發(fā)性NOA患者為病例組,提取外周血基因組DNA,應(yīng)用PCR擴增CDK2基因的7個外顯子及相應(yīng)側(cè)翼序列,并對其產(chǎn)物進(jìn)行測序,并分析CDK2基因是否存在異常堿基改變、插入或缺失。同時與NCB1提供的正常序列對照組比較。實驗結(jié)果:本研究中的NOA,包括HS 48例,MA 40例。結(jié)果未發(fā)現(xiàn)新發(fā)突變,在CDK2基因的7個外顯子中發(fā)現(xiàn)4個已知SNPs位點(4個已知SNPs分別是外顯子1中的c.324GA,外顯子2中的c.363TC,and3'UTR區(qū)的c.*570GA和c.*1160G〉C),并對上述位點進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,等位基因頻率和基因型頻率在病例組與對照組相比校無明顯差異,通過進(jìn)一步病理分型后,將HS和MA組分別與對照組進(jìn)行比較,等位基因頻率和基因型頻率均無差異。實驗結(jié)論:在本研究未發(fā)現(xiàn)新發(fā)突變,結(jié)果提示本地區(qū)男性特發(fā)性非梗阻無精子癥病理類型與CDK2基因編碼區(qū)序列改變可能是不相關(guān),特發(fā)性NOA病因有待進(jìn)一步深入研究。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R698.2

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 劉雯;李婷;于瑞梅;解磊;高選;;147例唯支持細(xì)胞綜合征患者的睪丸病理分型和性激素分析[J];山東大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2017年01期

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本文編號：1295649