本文關(guān)鍵詞：鈣庫操控的鈣離子通道在糖尿病大鼠膀胱收縮功能中作用的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：目的:構(gòu)建不同時間段STZ誘導(dǎo)的DM大鼠動物模型。通過激活或失活SOCCs通道,運(yùn)用離體逼尿肌肌條收縮實(shí)驗(yàn)來研究SOCCs在DCP疾病中對膀胱肌條收縮功能的作用。通過原代逼尿肌細(xì)胞分離培養(yǎng),培養(yǎng)出原代逼尿肌細(xì)胞。采用SOCCs的激活劑和抑制劑,研究激活或失活該通道后,DM大鼠膀胱逼尿肌細(xì)胞鈣離子濃度的變化。并研究不同糖尿病病程作用下,大鼠膀胱中SOCCs關(guān)鍵分子STIM1和Orai1的m RNA水平和蛋白水平表達(dá)的改變情況。方法:1.6-8周雌性S-D大鼠70只,按年齡分為每組10只,其中正常對照組(normal control,N組)4組,實(shí)驗(yàn)組(diabetes mellitus,DM組)3組。DM組:單次腹腔注射p H4.5,0.1mmol/L的檸檬酸緩沖液溶解的鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ),50mg/kg。N組:單次腹腔注射等體積的檸檬酸緩沖液。具體分組:DM組:(1)4周實(shí)驗(yàn)組(DM4W組):注射STZ,成模后4周處死。(2)8周實(shí)驗(yàn)組(DM8W):注射STZ,成模后8周處死。(3)12周實(shí)驗(yàn)組(DM12W):注射STZ,成模后12周處死。N組:(1)0周對照組(N0):注射緩沖液后3天后處死。(2)4周對照組(N1):注射緩沖液后4周后處死。(3)8周對照組(N2):注射緩沖液后8周后處死。(4)12周對照組(N3):注射緩沖液后12周后處死。注射藥物3天后測量隨機(jī)血糖三次,血糖值均大于16.7mmol/L,認(rèn)為DM模型構(gòu)建成功。其后觀察處死時血糖,大鼠體重等指標(biāo)變化,并留取膀胱組織進(jìn)行HE染色,評估膀胱組織學(xué)改變。2.分別制備8*3*3mm離體逼尿肌肌條,解剖顯微鏡下去除膀胱粘膜及漿膜層,置于kreb’s液中,通過給予環(huán)匹阿尼酸(cyclopiazonic Acid,CPA)激活SOCCs和SKF-96365抑制SOCCs來觀察各組離體逼尿肌肌條收縮頻率和收縮幅度的變化。3.采用酶消化法來分離逼尿肌細(xì)胞進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)。具體使用膠原蛋白酶Ⅱ4mg/ml及牛血清白蛋白(BSA)4mg/ml,在37℃,5%CO2的條件下消化40-60分鐘。觀察所獲得細(xì)胞形態(tài)、生長方式及α-SMA免疫熒光法檢測平滑肌細(xì)胞特異性。4.分離培養(yǎng)24h的原代逼尿肌細(xì)胞負(fù)載Fluo-4AM,通過激活和失活SOCCs通道,在激光共聚焦顯微鏡下觀察和記錄各組逼尿肌細(xì)胞熒光強(qiáng)度的變化,最后計(jì)算實(shí)測熒光強(qiáng)度(F1)比背景熒光強(qiáng)度(F0)的變化,即采用F1/F0來進(jìn)行比較在SOCCs激活和失活后,各組細(xì)胞鈣離子的變化。5.RT-q PCR法和Western Blot法測定不同時間DM大鼠膀胱組織STIM1和Orai1分子的表達(dá)水平。結(jié)果:1.DM組大鼠血糖均大于16.7mmol/l,體重連續(xù)降低,與對照組對比,DM組大鼠體重下降具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),膀胱擴(kuò)張明顯,可見膀胱尿潴留,血糖也明顯增高(p0.05)。HE染色提示隨著糖尿病進(jìn)展,DM組逼尿肌細(xì)胞增生,肥大,纖維組織排列紊亂,間質(zhì)疏松。2.加入CPA和SKF-96365后離體膀胱逼尿肌肌條收縮頻率變化:加入CPA后,所有實(shí)驗(yàn)組肌條收縮頻率均增加。與對照組比較,DM4W組和DM8W組肌條收縮頻率明顯增加(DM4W vs N1:t=3.776,p=0.002;DM8W vs N2:t=2.282,p=0.039)。DM三組實(shí)驗(yàn)組之間比較,DM4W組與DM12W,DM8W組與DM12W,均表現(xiàn)為收縮頻率增強(qiáng)(DM12W vs DM4W,p=0.039;DM12W vs DM8W,p=0.012),各個時間正常組間比較,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。加入SKF-96365后,所有實(shí)驗(yàn)組肌條收縮頻率降低。與對照組比較,DM4W和DM8W組肌條收縮頻率仍較高(DM4W vs N1:t=-3.750,p=0.02;DM8W vs N2:t=-2.593,p=0.021)DM三組之間比較,DM12W組較其他兩組明顯高(DM12W vs DM4W,p=0.004;DM12W vs DM8W,p=0.021),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,各個時間正常組間比較,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.加入CPA和SKF-96365后離體膀胱逼尿肌肌條收縮幅度變化:在所有實(shí)驗(yàn)組中加入CPA后,逼尿肌肌條收縮幅度均下降;在加入SKF-96365后,收縮幅度均有所回升,但仍小于沒加藥前。各組之間逼尿肌肌條收縮幅度比較,差異不明顯,沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.成功分離培養(yǎng)出膀胱逼尿肌細(xì)胞,細(xì)胞3-5天逐漸融合顯片狀生長,7天左右平滑肌融合達(dá)到80%以上。細(xì)胞呈平滑肌細(xì)胞典型的“峰-谷”樣生長,α-SMA免疫熒染色陽性。5.加入CPA后,激活SOCCs,所有實(shí)驗(yàn)組逼尿肌細(xì)胞相對熒光強(qiáng)度均增加,DM4W、DM8W與對照組比較相對熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)(DM4W vs N1:t=4.867,p=0.0002;DM8W vs N2:t=4.203,p=0.001),DM組之間比較,DM12W較其他兩組明顯降低(DM12W vs DM4W,p=0.001;DM12W vs DM8W,p=0.0004,DM8W vs DM4W,p=0.680),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。加入SKF-96365后,SOCCs失活,細(xì)胞相對熒光強(qiáng)度降低,與對照組比較DM4W,DM8W的熒光相對強(qiáng)度仍顯著高于對照組(DM4W vs N1:t=3.141,p=0.007;DM8W vs N2:t=3.871,p=0.002),DM組之間比較,DM12W較其他兩組明顯降低(DM12W vs DM4W,p=0.003;DM12W vs DM8W,p=0.002,DM8W vs DM4W,p=0.914)。6.在DM4W和DM8W組中,與對照組比較,Orai1m RNA和蛋白表達(dá)量顯著增加(m RNA:DM4W vs N1:t=6.049,p=0.0001;DM8W vs N2:t=4.122,p=0.002蛋白:DM4W vs N1:t=8.862,p=0.001;DM8W vs N2:t=10.803,p=0.0004)。STIM1m RNA表達(dá)量在DM4W組中顯著增加(t=2.799,p=0.019),STIM1蛋白表達(dá)量在DM4W和DM8W組中顯著增加(DM4W vs N1:t=6.540,p=0.003;DM8W vs N2:t=3.495)。DCP不同時間比較,Orai1m RNA的表達(dá)量在DM12W組中與其他DM組比較明顯降低(DM12W vs DM4W,p=0.0001;DM12W vs DM8W,p=0.001,DM8W vs DM4W,p=0.329);Orai1蛋白表達(dá)量也明顯降低(DM12W vs DM4W,p=0.007;DM12W vs DM8W,p=0.011,DM8W vs DM4W,p=0.717)。STIM1m RNA的表達(dá)量在DM4W組中較其他DM組明顯增加(DM4W vs DM8W,p=0.013;DM4W vs DM12W,p=0.002,DM8W vs DM12W,p=0.409),而STIM1蛋白表達(dá)量在DM三組間均不同(DM12W vs DM4W,p=0.0003;DM12W vs DM8W,p=0.003,DM8W vs DM4W,p=0.046)。結(jié)論:1.成功建立SZT誘導(dǎo)的DM大鼠模型。在DCP疾病中,SOCCs參與調(diào)節(jié)了膀胱逼尿肌的收縮功能,SOCCs對膀胱逼尿肌收縮頻率調(diào)節(jié)作用增強(qiáng)。2.采用酶消化法成功分離培養(yǎng)了膀胱逼尿肌細(xì)胞,SOCCs參與了DM大鼠膀胱逼尿肌細(xì)胞鈣離子濃度的調(diào)節(jié)。隨著DCP病程進(jìn)展,SOCCs對膀胱逼尿肌細(xì)胞鈣離子調(diào)節(jié)作用先增強(qiáng)(4、8周)后減弱(12周)。3.在DCP疾病4周時,Orai1和STIM1表達(dá)增強(qiáng),糖尿病影響了大鼠膀胱SOCCs關(guān)鍵分子Orai1和STIM1的表達(dá)水平。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R587.2;R694

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1 付杰新;良性前列腺增生癥的膀胱逼尿肌功能異常研究[J];廣西醫(yī)學(xué);2004年05期

2 何地英;瞿頌義;;膀胱逼尿肌的組織及生理學(xué)概述[J];西北民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2005年04期

3 陳宇東,宋波;不穩(wěn)定膀胱逼尿肌病理生理變化研究進(jìn)展[J];醫(yī)學(xué)新知雜志;2000年04期

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5 雙衛(wèi)兵;王東文;高宏飛;原小斌;;自由基在2型糖尿病大鼠膀胱逼尿肌損傷的作用與意義[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2009年19期

6 章振保,張時純,齊范,周芳堅(jiān);NOS在膀胱逼尿肌組織中的表達(dá)及意義[J];中華泌尿外科雜志;1998年10期

7 王華;侯巖松;何屹;楊林斌;俞增福;蔣振華;;糖尿病對膀胱逼尿肌興奮性、收縮性及順應(yīng)性影響的實(shí)驗(yàn)研究[J];臨床泌尿外科雜志;2008年02期

8 李振華,李剛,趙旭,王平;老年人膀胱逼尿肌β受體反應(yīng)性環(huán)腺苷酸水平變化及其調(diào)節(jié)機(jī)制[J];中華老年醫(yī)學(xué)雜志;2002年05期

9 滕若冰;梁月有;鄭克立;;M2、M3受體與膀胱逼尿肌關(guān)系的研究進(jìn)展[J];國際泌尿系統(tǒng)雜志;2006年05期

10 孫小兵,卜照耘,張維東,張圣軍,李宜生;TGF-β_1對膀胱逼尿�、笮湍z原表達(dá)的調(diào)節(jié)作用[J];中華小兒外科雜志;2005年03期

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1 吳君;吳清和;;膀胱逼尿肌相關(guān)受體概述[A];中華中醫(yī)藥學(xué)會中藥實(shí)驗(yàn)藥理分會第八屆學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];2009年

2 孫曉松;石洪波;張雪軍;周吉;門曉煒;陳斌;鄭濤;王銳;周飛;陳德紅;;膀胱出口部分梗阻膀胱逼尿肌中神經(jīng)組織分布的實(shí)驗(yàn)研究[A];第七次中國中西醫(yī)結(jié)合泌尿外科學(xué)術(shù)年會暨第二次廣東省中西醫(yī)結(jié)合泌尿外科學(xué)術(shù)年會論文集[C];2009年

3 張強(qiáng);李焱風(fēng);秦國政;張春和;;從補(bǔ)腎活血論治前列腺增生癥膀胱逼尿肌功能受損[A];新編男科理論與臨床——中華中醫(yī)藥學(xué)會第七屆中醫(yī)男科學(xué)術(shù)大會;全國中醫(yī)男科臨床與科研方法高級研修班;2006年云南省中醫(yī)男科診療技術(shù)培訓(xùn)班講義與論文集[C];2006年

4 李偉;鄭天珍;瞿頌義;;雌二醇對豚鼠膀胱逼尿肌收縮的影響[A];中國生理學(xué)會2004年消化內(nèi)分泌生殖學(xué)術(shù)研討會論文摘要匯編[C];2004年

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2 張春和;前列沖劑治療前列腺增生癥膀胱逼尿肌收縮功能受損的臨床研究[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2002年

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