發(fā)布時間：2017-12-16 10:20

  本文關(guān)鍵詞：D4Mil1e調(diào)控小鼠雌性配子成熟及早期胚胎發(fā)育的機理研究

  更多相關(guān)文章： D4Mil1e 卵母細胞 減數(shù)分裂 紡錘體 染色體中板集合 線粒體

【摘要】：研究背景:隨著環(huán)境的惡化和生活節(jié)奏與方式的改變,世界范圍內(nèi)人類生殖的能力下降早已成為國際社會共同關(guān)注的問題,不孕不育癥已然成為世界醫(yī)學界亟待解決的重要難題。盡管人類輔助生殖技術(shù)(Assisted Reproductive Technology,ART)為不孕不育癥患者帶來了福音,但諸如卵母細胞體外成熟率及受精率低、配子染色體異倍性高;胚胎發(fā)育潛能低下等問題,仍是造成早期胚胎流產(chǎn)或后代出生缺陷的主要原因。在卵母細胞減數(shù)分裂成熟過程中,染色體倍數(shù)減半是保證后代正常發(fā)育的關(guān)鍵因素之一。大量的研究表明,許多分子參與并調(diào)控了染色體和紡錘體動力學過程,這些分子發(fā)揮正常功能離不開物質(zhì)運輸這一重要的細胞功能。驅(qū)動蛋白是1985年發(fā)現(xiàn)的一類細胞內(nèi)單體分子馬達,它能利用三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)水解所釋放的能量,驅(qū)動自身及所攜帶的貨物分子沿微管進行運動。雖然大多數(shù)驅(qū)動蛋白都具有相同的酶促反應區(qū)域,但每一種驅(qū)動蛋白都有自己獨特的亞細胞定位與功能。D4Mil1e也被稱作驅(qū)動蛋白家族成員1B(kinesin family member 1B,KIF1B),它作為一種重要的微管依賴性順式分子馬達,是驅(qū)動蛋白超家族重要的成員之一。在體細胞中,它主要負責線粒體等膜性細胞器及突觸囊泡的胞內(nèi)運輸;并且作為一個潛在的腫瘤抑制因子,通過調(diào)控細胞凋亡參與多種惡性腫瘤及其他疾病的發(fā)生。研究目的:本研究以小鼠卵母細胞為對象,使用體外成熟、體外受精、顯微注射、蛋白免疫印跡、免疫熒光染色及染色體鋪片等技術(shù),深入地研究了 D4Mil1e在小鼠卵母細胞減數(shù)分裂成熟過程中的精確表達、定位及其功能,以及它在受精后合子第一次有絲分裂時的作用。本論文系統(tǒng)全面地展示了卵母細胞減數(shù)分裂成熟及早期胚胎發(fā)育過程中9個連續(xù)的時期內(nèi)D4Mil1e的精確定量及精細亞細胞定位情況,進一步探索出在配子、胚胎多個重要時期內(nèi),D4Mil1e與紡錘體、染色體以及線粒體的相關(guān)作用及其機理。這不僅首次全面地闡明了 D4Mil1e對哺乳動物卵母細胞減數(shù)分裂成熟及早期胚胎發(fā)育的調(diào)控機制,更為治療人類不孕不育癥和改進輔助生殖技術(shù)提供了有價值的理論基礎。研究方法:(1)本研究通過孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin,PMSG)聯(lián)合人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrop,hCG)的超數(shù)排卵技術(shù)、體外受精技術(shù)(in vitro fertilization,IVF)獲得 GV 期(germinal vesicle)、生發(fā)泡破裂期(germinal vesicle breakdown,GVBD)、第一次減數(shù)分裂中期(metaphase Ⅰ,MI)、第一次減數(shù)分裂后-末期(anaphase Ⅰ/telophaseI,AI-TI)、第二次減數(shù)分裂中期(metaphase Ⅱ,MII)、第二次減數(shù)分裂后-末期(anaphase Ⅱ/telophase Ⅱ,AII-TII)、原核期(pronucleus,PN)、1細胞胚胎后期(Late 1-cell)、2細胞胚胎期(2-cell),這9個連續(xù)時期的卵母細胞及早期胚胎。通過蛋白免疫印跡(Western blotting)、免疫熒光染色(immunofluorescence)、激光共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope)掃描技術(shù),檢測D4Mil1e在卵母細胞成熟和早期胚胎發(fā)育各階段的精確定量和精細亞細胞定位。(2)在上述實驗結(jié)果的基礎上,進一步使用紡錘體干擾藥物紫杉醇(taxol)和諾考達唑(nocodazole)分別處理MII期卵母細胞,通過免疫熒光染色、激光共聚焦顯微鏡掃描技術(shù)檢測微管破壞后D4Mil1e的定位情況。進一步確證D4Mil1e與微管的關(guān)系。(3)在確定D4Mil1e與微管蛋白有相互作用的基礎上,采用特異性和穩(wěn)定性更強的嗎啉基寡核苷酸(Mopholino,MO)敲減方法,在GV期卵母細胞中以顯微注射的方式敲減D4Mil1e,抑制D4Mil1e的mRNA翻譯。通過Western blotting和免疫熒光染色技術(shù)檢測其敲減效率;統(tǒng)計GVBD率,在解除米力農(nóng)抑制4小時、8小時、12小時、16小時后分別統(tǒng)計第一極體(the first polar body,PB1)排放率;使用CellSens Standard軟件測量中期板厚度,分析解除米力農(nóng)抑制12小時、16小時后卵母細胞中紡錘體-染色體復合體(spindle-chromosome complex,SCC)動力學;使用染色體鋪片技術(shù)統(tǒng)計染色體異倍性。(4)更進一步,為驗證D4Mil1e在早期胚胎發(fā)育中的作用,使用特異性MO,在合子啟動有絲分裂時的PN期以顯微注射的方式敲減D4Mil1e,通過Western blotting檢測其敲減效率;追蹤統(tǒng)計后續(xù)胚胎發(fā)育情況;通過免疫熒光染色技術(shù)分析胚胎發(fā)育質(zhì)量。(5)為了進一步驗證D4Mil1e在合子基因組激活前后(zygotic genome activation,ZGA)對胚胎發(fā)育的影響,我們使用沖胚技術(shù)獲取體內(nèi)發(fā)育的2-cell期胚胎,在合子基因組激活的2-cell胚胎階段,首次采用"同一胚胎不同卵裂球差異敲減技術(shù)",進一步確證D4Mil1e對胚胎有絲分裂的影響。在兩個卵裂球中使用特異性MO以顯微注射的方式,分別注射Ctrl MO+Ctrl MO,CtrlMO+D4mil1e MO和D4mil1eMO+D4mil1e MO,通過免疫熒光染色技術(shù)檢測紡錘體的組裝和染色體的排列情況,分析胚胎發(fā)育質(zhì)量,追蹤統(tǒng)計后續(xù)胚胎發(fā)育情況。(6)在已經(jīng)獲得MO敲減數(shù)據(jù)的基礎上,為進一步確證D4Mil1e的功能,使用特異性D4Mil1e抗體,分別在GV及MII期卵母細胞中以顯微注射的方式,直接在蛋白水平抑制D4Mil1e的表達后,統(tǒng)計GVBD率,在解除米力農(nóng)抑制4小時、8小時、12小時、16小時后統(tǒng)計PB1的排放率;使用CellSens Standard軟件測量紡錘體尺寸并計算其長寬比,使用染色體鋪片技術(shù)統(tǒng)計染色體異倍性;追蹤統(tǒng)計受精后各時期的胚胎發(fā)育情況。(7)在確證D4Mil1e的缺失導致小鼠卵母細胞和胚胎發(fā)育異常的基礎上,進一步對其可能發(fā)揮功能的下游機理進行了探討。使用特異性MO,在GV期卵母細胞中敲減D4Mil1e以介導其功能失調(diào),通過免疫熒光染色技術(shù)和NIS Elements Viewer軟件檢測成熟卵母細胞在線粒體分布和總ATP水平上的變化。研究結(jié)果:(1)本研究首次全面系統(tǒng)的證明了 D4Mil1e的定量、定位與卵母細胞成熟和胚胎發(fā)育進程均具有很高的相關(guān)性。結(jié)果首次完整地展示了在卵母細胞(GV期、GVBD期、MI期、AI-TI期、MII期)和早期胚胎(AII-TII期、PN期、Late 1-cell期、2-cell期)連續(xù)的9個時期內(nèi),D4Mil1e的蛋白表達水平、趨勢及亞細胞結(jié)構(gòu)定位。western blotting結(jié)果顯示,在卵母細胞最重要的GV期到2-cell胚胎期中,D4Mil1e蛋白水平呈現(xiàn)間期低、中期高的表達趨勢。免疫熒光染色結(jié)果顯示,在減數(shù)分裂和第一次有絲分裂進程中,D4Mil1e的積累顯示出動態(tài)的定位模式。(2)本研究進一步闡述D4Mil1e與微管動力學之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示經(jīng)抑制微管解聚的藥物taxol處理后,大部分D4Mil1e與異常的紡錘體共定位,少部分彌散分布于胞質(zhì);經(jīng)促進微管解聚的藥物nocodazole處理后,微管完全解聚,D4Mil1e隨之彌散分布于胞質(zhì)中。(3)本研究繼續(xù)揭示D4Mil1e生物學作用對卵母細胞成熟的影響及其機制。Western blotting結(jié)果顯示,在GV期卵母細胞中注射D4mil1e MO后,D4Mil1e的表達量下降了 81.8%(P0.01);免疫熒光染色結(jié)果顯示,D4Mil1e定位異常,證明該方法具有很高的敲減效率;雖然D4mil1e MO注射組卵母細胞的GVBD率不受影響;但在成熟過程中PB1的排放率顯著降低;卵母細胞成熟時中期板厚度增加了 2.2倍;紡錘體染色體復合體(spindle chromosome complexus,SCCs)出現(xiàn)成球期阻滯、紡錘體極形態(tài)改變、染色體錯排的情況,且與對照組相比(成球期阻滯:3.5±1.2%,紡錘體極形態(tài)改變:9.8±1.0%,染色體錯排6.3±1.7%),這些異常類型的比例分別升高至15.5±2.6%、37.1±2.0%及26.7±2.6%(P0.01);培養(yǎng)至成熟后,染色體異倍性發(fā)生率較對照組相比增加了 14.4倍(control MO:2.9±1.8%,D4mil1eMO:44.6±5.2%,P10-5)。(4)本研究揭示了 D4Mil1e對合子發(fā)育有重要影響。Western blotting結(jié)果顯示,在PN期合子中用MO敲減D4Mil1e后,D4Mil1e的表達量下降了 74.1%(P0.001);與 control MO 注射組相比(2-cell期:94.8± 1.2%,4-cell期:81.3±7.1%,桑椹胚期:73.5±5.9%,囊胚期:57.0±7.2%),D4ml1eMO 注射組 2-cell 期、4-cell期、桑椹胚期(Morula)及囊胚期(Blastocyst)的胚胎發(fā)育率分別下降至85.6±3.6%,27.7±3.8%,19.5±2.5%及 5.7±4.4%(P0.05);免疫熒光染色結(jié)果顯示,在敲減D4Mil1e后,PN期合子啟動第一次有絲分裂時,紡錘體的組裝以及染色體的排布都發(fā)生了異常;桑椹胚期細胞數(shù)比對照組減少了 56.5%;囊胚質(zhì)量降低,不能形成正常的囊胚腔,胚胎發(fā)生碎片化及2-cell阻滯。(5)本研究進一步通過首創(chuàng)的"同一胚胎不同卵裂球差異敲減技術(shù)",證明D4Mil1e對早期胚胎發(fā)育的具有調(diào)控作用。Western blotting結(jié)果顯示,在2-cell期胚胎中用MO敲減D4Mil1e后,在Ctrl MO+D4mil1e MO注射組中D4Mil1e的表達量下降了 61.8%(P0.001),在 D4mil1eMO+D4mil1eMO 注射組中D4Mil1e的表達量下降了 90.8%(P10-4),證明該方法所介導的敲減是高效的;Ctrl MO+D4mil1e MO注射組4-cell期、桑椹胚期及囊胚期的胚胎發(fā)育率分別下降至 44.5±2.5%,35.0±2.9%及 23.6± 1.2%(P10-4),D4mil1eMO+D4mil1e MO 注射組4-cell期、桑椹胚期及囊胚期的胚胎發(fā)育率分別下降至30.9 ± 3.2%,14.3 ± 2.7%及 8.7±0.4%(P10-5),與 Ctrl MO+Ctrl MO 注射組(4-cell 期:85.6±2.3%,桑椹胚期:77.1±1.8%,囊胚期:70.8±2.8%)相比均具有統(tǒng)計學差異;免疫熒光染色結(jié)果顯示,在Ctrl MO+D4mil1eMO注射組中,注射D4mil1e MO的卵裂球發(fā)生明顯的紡錘體異常和染色體錯排;Ctrl MO+D4mil1e MO和D4mil1e MO+D4mil2e MO注射組桑椹胚期細胞數(shù)分別減少40.0%和57.2%;囊胚質(zhì)量隨卵裂球D4Mil1e敲減程度的加劇而顯著下降。(6)本研究利用抗體封閉技術(shù)進一步證明D4Mil1e生物學功能對卵母細胞成熟及胚胎發(fā)育的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在GV期卵母細胞中,使用D4Mil1e特異性抗體在蛋白水平抑制D4Mil1e后,雖然不影響GVBD率,但卵母細胞成熟時PB1的排放率顯著下降;MI及MII期卵母細胞紡錘體長寬比顯著下降;且SCCs出現(xiàn)成球期阻滯、紡錘體極形態(tài)改變、染色體錯排的情況,與對照組相比(MI期卵母細胞成球期阻滯:4.0±0.8%,紡錘體極形態(tài)改變:10.0±1.2%,染色體錯排7.7±0.9%;MII期卵母細胞成球期阻滯:2.9±1.0%,紡錘體極形態(tài)改變:8.7±2.0%,染色體錯排5.8±1.5%),在MI期卵母細胞中這些異常類型的比率分別升高至13.4± 1.4%,30.5± 1.3%及 25.6± 1.3%(P0.01),在 MII 期卵母細胞中這些異常類型的比率分別升高至11.0± 1.3%,25.2±2.8%及21.4±2.2%(P0.01);培養(yǎng)至成熟后,染色體異倍性發(fā)生率較對照組相比增加了 6倍(IgG注射組:3.8±2.4%,D4Mil1e抗體注射組:26.6±1.3%,P0.01)。在MII期卵母細胞中使用抗體封閉技術(shù)后,與對照組相比(2-cell期:56.3±4.1%,4-cell期:34.6±5.1%,桑椹胚期:27.9±4.2%,囊胚期:18.9±4.5%),D4Mil1e抗體注射組卵母細胞受精后的2-cell期、4-cell期、桑椹胚期及囊胚期的胚胎發(fā)育率分別下降至47.4±2.4%,19.5± 1.8%,13.7± 1.1%及 7.3±2.5%(P0.05)。(7)本研究進一步從能量代謝角度揭示D4Mil1e生物學功能對卵母細胞成熟的影響及其機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在GV期卵母細胞中用MO敲減D4Mil1e后,在M期卵母細胞中,胞質(zhì)中線粒體凝集現(xiàn)象消失,線粒體分布異常;MI期卵母細胞中總ATP水平下降至0.3±0.1,與對照組(1.0±0.1)相比下降了 72.0%(P10-3);MII期卵母細胞中總ATP水平下降至0.7±0.02,與對照組(1.0±0.1)相比下降了34.0%(P0.01)。結(jié)論:本論文首次證明:(1)D4Mil1e蛋白表達水平及其亞細胞定位與小鼠卵母細胞減數(shù)分裂成熟及早期胚胎發(fā)育進程高度相關(guān);(2)在卵母細胞及早期胚胎中干擾D4Mil1e的功能,會導致卵母細胞減數(shù)分裂成熟失敗及后續(xù)胚胎發(fā)育受損;(3)在卵母細胞中干擾D4Mil1e的功能,會導致線粒體分布異常及ATP水平下降;(4)本研究首次系統(tǒng)全面的闡述了 D4Mil1e通過微管依賴機制在卵母細胞的紡錘體組裝及染色體中板集合過程中起重要作用。為配子發(fā)生的機理和臨床染色體異倍性疾病的發(fā)生提供了理論依據(jù)。
【學位授予單位】：內(nèi)蒙古大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R711.59

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本文編號：1295673