本文關(guān)鍵詞：SVF-gel：一種高濃度脂肪來源干細(xì)胞基質(zhì)膠的實驗研究及臨床應(yīng)用

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【摘要】：研究背景和目的當(dāng)前脂肪來源干細(xì)胞(ASCs)的應(yīng)用已經(jīng)擴(kuò)展至臨床諸多領(lǐng)域,最為盛行的是應(yīng)用于整形外科領(lǐng)域的脂肪移植,然而,該法卻始終面臨著一些臨床應(yīng)用的困境,例如分離流程復(fù)雜、需要引入外源的、異種的酶蛋白消化組織等等。傳統(tǒng)的化學(xué)消化法所分離獲得基質(zhì)血管片段(SVF)為細(xì)胞懸液,并非黏附在細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)上的生理狀態(tài),所以移植后ASCs易被宿主巨噬細(xì)胞吞噬,使成熟脂肪細(xì)胞和ASCs均不能長久成活,這是導(dǎo)致脂肪移植保留率不穩(wěn)定的主要原因。2013年納米脂肪(Nanofat)的問世給了我們很大的啟示,該法是通過物理方法將脂肪組織處理成一種近似干細(xì)胞懸液的狀態(tài),以此進(jìn)行真皮內(nèi)注射,達(dá)到干細(xì)胞療法的效果。雖然Nanofat選擇性破壞了脂肪細(xì)胞,達(dá)到了可通過銳針注射的目的,但由于其含有大量腫脹液及脂滴成分,最主要的SVF細(xì)胞濃度甚至低于普通脂肪組織,因此無法達(dá)到干細(xì)胞療法的要求。能否通過純物理手段獲取高濃度SVF/ASC細(xì)胞的同時,又最大程度獲得起保護(hù)作用的ECM呢?故本研究目的在于通過對Nanofat進(jìn)一步的處理,提取一種富集SVF細(xì)胞和ECM的高濃度產(chǎn)物,以提高脂肪移植的成活率和穩(wěn)定性,特命名為脂肪來源干細(xì)胞基質(zhì)膠ECM/SVF-gel。實驗分為以下幾個方面:1)ECM/SVF-gel的定義及標(biāo)準(zhǔn)制備流程的確定;2)ECM/SVF-gel中各細(xì)胞亞群成分分析;3)ECM/SVF-gel作為干細(xì)胞療法促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)的實驗研究;4)ECM/SVF-gel作為高保留率的組織移植材料,移植后的結(jié)構(gòu)變化;5)ECM/SVF-gel的臨床應(yīng)用。方法與實驗結(jié)果將抽吸獲得的脂肪組織進(jìn)行不同時間的機(jī)械力處理、去油,實驗結(jié)果顯示所獲得的ECM/SVF-gel,在處理1分鐘后,體積基本穩(wěn)定,脂肪組織的脫油率在85%至90%。我們將脂肪組織從抽吸到制成Nanofat再到ECM/SVF-gel,制定出標(biāo)準(zhǔn)化流程,其中運(yùn)用流體渦旋以及絮凝沉淀的物理學(xué)原理,最終獲得ECM/SVF-gel的濃縮脂肪組織。ECM/SVF-gel呈膠凍狀,可通過27g銳針進(jìn)行皮內(nèi)注射,與脂肪抽吸物相比質(zhì)地更為均勻。ECM/SVF-gel的電鏡觀察,可見其中含有大量的ECM成分,并且短時間內(nèi)隨著物理處理時間的延長,ECM結(jié)構(gòu)基本保持完整。免疫熒光共聚焦結(jié)果以及流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示,ECM/SVF-gel與正常脂肪組織以及Nanofat相比,去除了絕大多數(shù)的成熟脂肪細(xì)胞和油脂,保留大量的血管片段、細(xì)胞外基質(zhì),SVF細(xì)胞數(shù)量達(dá)到了正常脂肪組織的4～5倍,而CD34+細(xì)胞達(dá)到了處理前的6倍。將提取的SVF細(xì)胞貼壁培養(yǎng),進(jìn)行成脂、成骨以及成軟骨分化誘導(dǎo),結(jié)果顯示,物理處理后存活的干細(xì)胞并未受到機(jī)械力的影響,依然具有多向分化能力。將ECM/SVF-gel應(yīng)用于動物創(chuàng)面愈合模型,實驗結(jié)果顯示,較單純注射SVF組,ECM/SVF-gel對促進(jìn)創(chuàng)面愈合作用更加明顯。將新鮮制備的hECM/SVF-gel移植至裸鼠背部皮下,在移植后兩周、四周以及更長的3個月時間點觀察,ECM/SVF-gel移植后保留率非常穩(wěn)定,遠(yuǎn)期保留率高于80%。移植物組織切片觀察,ECM/SVF-gel移植后組織內(nèi)空洞及壞死組織明顯少于普通脂肪移植組。移植后14天,組織內(nèi)出現(xiàn)大量小細(xì)胞,并在移植一個月后即可觀察到均一的脂肪細(xì)胞,而普通脂肪移植后則出現(xiàn)明顯組織壞死、纖維化結(jié)構(gòu)以及較大空泡。同步進(jìn)行的臨床試驗結(jié)果顯示,ECM/SVF-gel對于頸部皺紋、面部凹陷以及局部皮膚色素沉著等衰老性表現(xiàn)的治療作用十分顯著。結(jié)論1、ECM/SVF-gel是自體脂肪組織經(jīng)純物理方法處理后獲得的、由高濃度生物活性細(xì)胞外基質(zhì)ECM、脂肪來源干細(xì)胞ASCs構(gòu)成的、可注射的凝膠狀脂肪移植材料。2、按照本課題組制定的標(biāo)準(zhǔn)流程制備出的ECM/SVF-gel中,SVF細(xì)胞仍處于粘附在ECM上的正常生理狀態(tài),二者均保留了相對完整性和生物活性。3、ECM/SVF-gel促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的作用優(yōu)于SVF細(xì)胞懸液,其在干細(xì)胞療法領(lǐng)域的應(yīng)用前景廣闊。4、ECM/SVF-gel移植后的成活/再生模式異于普通脂肪組織,可顯著提高其遠(yuǎn)期保留率。5、ECM/SVF-gel制備簡單、使用安全,符合當(dāng)前政策法規(guī)對于臨床進(jìn)行組織/細(xì)胞移植的要求,經(jīng)初步臨床觀察,在干細(xì)胞療法和組織移植應(yīng)用方面均明顯優(yōu)于傳統(tǒng)方法,具有廣泛的臨床應(yīng)用前景,值得深入研究和推廣應(yīng)用。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R622

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