本文關(guān)鍵詞：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)定蛋白CHERP對神經(jīng)母細胞瘤細胞增殖與凋亡的調(diào)控研究

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【摘要】：神經(jīng)母細胞瘤是一種常見的惡性腫瘤,由兒童交感神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育而來,通常發(fā)生在5歲以前。神經(jīng)母細胞瘤的癥狀包括腹部腫塊、疼痛、腹瀉或一般不適感。神經(jīng)母細胞瘤死亡率占兒童腫瘤相關(guān)死亡人數(shù)的12%。了解神經(jīng)母細胞瘤發(fā)生和發(fā)展的確切機制,將有助于改善對這個知之甚少的腫瘤預防和治療策略。在本論文中,我們發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)定蛋白CHERP參與調(diào)控神經(jīng)母細胞瘤細胞增殖、細胞凋亡和致瘤性等過程。本研究發(fā)現(xiàn),下調(diào)CHERP蛋白能夠引起細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應,從而導致DR5表達和激活,并且抑制AKT/m TOR信號通路,最終導致細胞凋亡。此外我們使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應特異性抑制劑GSK2606414能夠部分挽救由干擾CHERP引起的細胞凋亡。實驗表明干擾CHERP能夠觸發(fā)神經(jīng)母細胞瘤細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應引起下游ATF4/CHOP/DR5通路激活并抑制AKT/m TOR信號通路從而誘導神經(jīng)母細胞瘤發(fā)生凋亡反應。本研究結(jié)果表明CHERP可能為神經(jīng)母細胞瘤病人臨床診斷提供潛在靶點并制定新的治療策略。本論文主要研究結(jié)果如下:1.在神經(jīng)母細胞瘤病人中CHERP高表達與患者預后差有關(guān)為了研究CHERP的異常表達是否與神經(jīng)母細胞瘤患者預后有關(guān),我們利用網(wǎng)絡資源R2數(shù)據(jù)庫:基因組分析和可視化平臺檢索CHERP在神經(jīng)母細胞瘤公共數(shù)據(jù)庫(Tumor Neuroblastoma public database)中表達情況。我們使用了3個常用的數(shù)據(jù)庫(Versteeg,Kocak和Asgharzadeh),這3個數(shù)據(jù)庫分別包含有88,476和247例神經(jīng)母細胞瘤患者,利用這3個數(shù)據(jù)庫預測CHERP與神經(jīng)母細胞瘤患者預后的關(guān)系。Kaplan Meier分析,CHERP表達量高,神經(jīng)母細胞瘤患者整體存活率低,CHERP表達量低,神經(jīng)母細胞瘤患者整體存活率高。其次,在Versteeg數(shù)據(jù)庫中分析發(fā)現(xiàn),腫瘤患者死亡情況、診斷年齡和致死原因都與CHERP表達水平有關(guān)。此外,我們還分析了CHERP表達水平是否與原癌基因MYCN有聯(lián)系。結(jié)果顯示,在MYCN擴增的患者人群CHERP表達水平明顯高于非擴增人群。這些結(jié)果暗示CHERP可能是一個神經(jīng)母細胞瘤患者的潛在的診斷標記。為了進一步驗證以上結(jié)果,我們還利用了另一個網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫資源:原癌基因數(shù)據(jù)庫(Neuroblastoma Prognosis Database),Kaplan Meier分析同樣顯示高水平的CHERP與神經(jīng)母細胞瘤不良預后有關(guān)。此外在Kocak數(shù)據(jù)庫中還發(fā)現(xiàn),惡性程度最高的IV期腫瘤中CHERP表達水平顯著高于其他時期腫瘤。以上結(jié)果表明,高水平的CHERP蛋白與神經(jīng)母細胞瘤患者整體生存率及預后有關(guān),因此我們推斷CHERP可能作為神經(jīng)母細胞瘤患者診斷的一個標志物。2.CHERP在神經(jīng)母細胞瘤細胞系高表達且定位于細胞核為了研究CHERP在神經(jīng)母細胞瘤中的表達情況,我們首先利western blotting和q RT-PCR檢測了CHERP在6種神經(jīng)母細胞瘤細胞系中表達量。我們發(fā)現(xiàn)CHERP在6種神經(jīng)母細胞瘤細胞系中普遍表達,在BE(2)-C表達量最高,在SHEP1細胞中表達量最低。前人研究報道顯示在大鼠肌肉細胞中CHERP與Ry R1結(jié)合并定位在肌漿網(wǎng),而最新的報道顯示在HEK293和SKBR3細胞系中CHERP扮演核蛋白作用,影響細胞增殖。為了確認CHERP在神經(jīng)母細胞瘤細胞系中的具體表達位置,我們抽提了細胞漿蛋白和細胞核蛋白。western blotting結(jié)果顯示在BE(2)-C,SK-N-DZ和SHEP1 3個細胞系中,CHERP只定位在細胞核,細胞質(zhì)中未能檢測到目的蛋白。進一步通過免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)CHERP只定位于細胞核,細胞質(zhì)中未檢測到信號。這些結(jié)果顯示,CHERP在神經(jīng)母細胞瘤細胞系中普遍表達,而且定位于細胞核內(nèi)。3.干擾CHERP抑制神經(jīng)母細胞瘤細胞增殖為了研究CHERP在神經(jīng)母細胞瘤的中的重要性,我們應用攜帶小發(fā)夾RNA(sh RNA)的慢病毒系統(tǒng)構(gòu)建了靶向干擾CHERP的重組質(zhì)粒(CHERPsi-1#,CHERPsi-2#和對照組GFPsi)感染BE(2)-C和SHEP1細胞系。通過western blotting和q RT-PCR分析重組載體能有效的下調(diào)CHERP水平。干擾CHERP后,細胞數(shù)量顯著性下降,細胞形態(tài)也發(fā)生改變。進一步通過CCK-8生長曲線實驗也驗證了干擾CHERP能夠顯著抑制細胞生長增殖這一結(jié)論。這些結(jié)果顯示CHERP在神經(jīng)母細胞瘤細胞增殖過程扮演不可缺少的角色。4.干擾CHERP誘導神經(jīng)母細胞瘤細胞周期阻滯在G0/G1期前文數(shù)據(jù)表明干擾CHERP抑制神經(jīng)母細胞瘤增殖,而許多證據(jù)表明細胞增殖往往與細胞周期有密切聯(lián)系。因此,我們利用流式細胞術(shù)檢測了BE(2)-C和SHEP1干擾CHERP后細胞周期變化情況。結(jié)果顯示與GFPsi對照組相比,干擾CHERP能夠顯著增加G0/G1期細胞比例,S期細胞比例顯著降低。此外,我們利用增殖標志物Ki-67去標記細胞發(fā)現(xiàn)與對照組相比,CHERP干擾后Ki-67陽性細胞比例顯著降低,說明細胞增殖受到抑制。為了驗證以上結(jié)果,我們使用western blotting檢測了G0/G1細胞周期檢驗點相關(guān)蛋白表達情況。實驗結(jié)果顯示干擾CHERP后,細胞內(nèi)CDK2和Cyclin E蛋白水平顯著降低,而CDK1,CDK4和Cyclin B1蛋白表達水平?jīng)]有明顯變化。這些結(jié)果證明了干擾CHERP能夠通過降低CDK2和Cyclin E表達水平從而誘導細胞周期阻滯在G0/G1時期,導致神經(jīng)母細胞瘤細胞增殖受到抑制。5.干擾CHERP誘導神經(jīng)母細胞瘤細胞凋亡細胞凋亡可能導致細胞增殖抑制及腫瘤生長抑制,所以我們檢測了干擾CHERP是否導致誘導細胞發(fā)生凋亡反應。首先通過Hoechst 33258染色,發(fā)現(xiàn)對照GFPsi組細胞細胞核具有大而圓亮的細胞核膜,而干擾CHERP的實驗組細胞核出現(xiàn)亮藍色碎片,暗示干擾CHERP可能夠誘導神經(jīng)母細胞瘤細胞凋亡。量化細胞核碎片所占比例發(fā)現(xiàn)與GFPsi組相比,干擾CHERP導致細胞核碎片比例大幅增加。進一步用FITC Annexin-V和PI染色后用流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)干擾CHERP后凋亡細胞數(shù)目顯著的增加。下一步,我們應用western blotting檢測了凋亡相關(guān)蛋白表達水平。發(fā)現(xiàn)干擾CHERP后Cle-caspase-3和Cle-caspase-8大幅上調(diào)。這些結(jié)果顯示了干擾CHERP能夠誘導神經(jīng)母細胞瘤細胞凋亡。6.干擾CHERP導致神經(jīng)母細胞瘤細胞活力降低及對抗腫瘤藥物敏感性增加腫瘤的一大特征就是其具有耐藥性。我們接下來研究了干擾CHERP是否影響神經(jīng)母細胞瘤細胞對抗腫瘤藥物doxorubicin(Dox)的敏感性。我們用2 u M Dox處理神經(jīng)母細胞瘤細胞,發(fā)現(xiàn)與對照組相比,經(jīng)過Dox藥物處理后BE(2)-C和SHEP1細胞形成克隆明顯減少,說明干擾CHERP能夠損壞細胞對Dox的耐藥性。此外,western blotting結(jié)果也顯示,干擾CHERP后,經(jīng)過Dox處理組Cle-caspase-3和Cle-caspase-8蛋白水平顯著增加。這些結(jié)果表明干擾CHERP能夠削弱神經(jīng)母細胞瘤細胞藥物敏感性及降低細胞活力。7.干擾CHERP抑制AKT/m TOR信號通路活性,并通過CHOP/DR5通路誘導神經(jīng)母細胞瘤細胞凋亡前文研究發(fā)現(xiàn)干擾CHERP能誘導神經(jīng)母細胞瘤細胞凋亡,增加Cle-caspase-3和Cle-caspase-8蛋白水平。文獻報道大部分神經(jīng)母細胞瘤細胞表現(xiàn)出耐藥性是由于其低表達caspase-8蛋白,同時有文獻報道腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體受體2(TRAIL-R2/DR5/TNFRSF10b)是caspase-8的一個上游調(diào)控原件。因此我們檢測了干擾CHERP蛋白后DR5表達水平變化。與我們預期結(jié)果一致,干擾CHERP后DR5蛋白水平和m RNA水平顯著增加。據(jù)報道,腫瘤細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應(ERS)能夠誘導DR5轉(zhuǎn)錄翻譯。為了研究在神經(jīng)母細胞瘤細胞中DR5轉(zhuǎn)錄翻譯是否受到ERS調(diào)控,我們檢測了ERS相關(guān)的標志蛋白BIP,ATF4和CHOP。發(fā)現(xiàn)干擾CHERP,BIP,ATF4和CHOP蛋白水平顯著增加,暗示ERS參與到干擾CHERP所誘導的細胞凋亡過程。為了進一步確認這個結(jié)論,我們應用了ERS特異性抑制劑GSK2606414處理細胞,實驗結(jié)果顯示Cle-caspase-3和Cle-caspase-8蛋白水平相對陰性對照組顯著降低,CHOP和DR5蛋白水平也有所降低。此外本研究還發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)m TOR和AKT磷酸化水平都顯著降低,暗示AKT/m TOR信號通路參與到干擾CHERP誘導細胞凋亡過程。這些結(jié)論暗示ERS和AKT/m TOR信號通路參與到由干擾CHERP所引起的細胞凋亡過程,并且DR5在此過程扮演重要角色。8.干擾CHERP抑制神經(jīng)母細胞瘤細胞的體外克隆形成能力以及抑制細胞體內(nèi)成瘤能力為了研究干擾CHERP是否對神經(jīng)母細胞瘤成瘤能力有影響,我們首先采取了了軟瓊脂單克隆實驗進行研究。結(jié)果顯示干擾CHERP后細胞形成的單克隆數(shù)目和大小都有所減小。此外我們利用免疫缺陷鼠研究了CHERP與神經(jīng)母細胞瘤細胞成瘤能力的影響,結(jié)果顯示干擾CHERP的BE(2)-C細胞在小鼠皮下未能形成腫瘤。這些結(jié)果暗示,CHERP與神經(jīng)母細胞瘤細胞克隆形成能力和腫瘤形成能力有密切聯(lián)系。MYCN是一個經(jīng)典的原癌基因,高水平的MYCN往往與惡性神經(jīng)母細胞瘤有關(guān),也預示著患者臨床預后不好。根據(jù)我們數(shù)據(jù)庫分析顯示,在MYCN擴增患者人群CHERP也顯著高于非MYCN擴增人群,為了驗證這一結(jié)論,我們在神經(jīng)母細胞瘤細胞系檢測了MYCN與CHERP表達水平是否存在聯(lián)系。我們發(fā)現(xiàn)干擾CHERP過后,MYCN蛋白水平顯著降低。
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R739.4

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本文編號：1295419