本文關(guān)鍵詞：基于Reelin蛋白研究先天腎虛影響大腦皮質(zhì)發(fā)育的分子機(jī)制

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【摘要】：目的本實(shí)驗(yàn)采用“恐傷孕鼠”的方法復(fù)制腎精虧虛的模型,研究Reelin蛋白對(duì)先天腎虛仔鼠腦發(fā)育的影響機(jī)制。方法①本實(shí)驗(yàn)采用3月齡SD(Sprague-Dawley)大鼠雌性40只,雄性20只,將其按2:1的比例合籠配對(duì)。受孕后的雌鼠用隨機(jī)取數(shù)法分為正常組、模型組和補(bǔ)腎組,每組各10只。自懷孕第一天起,模型組和補(bǔ)腎組每日以恐嚇為主的復(fù)合應(yīng)激刺激孕鼠。補(bǔ)腎組自造模第一天起,每日予中藥左歸丸濃縮劑2ml/100g體重灌胃,正常組及模型組亦根據(jù)雌鼠體重予以生理鹽水灌胃,造模時(shí)間為整個(gè)妊娠至分娩期間。雌鼠分娩后,分別計(jì)算各組雌鼠每胎生產(chǎn)數(shù)(仔鼠總數(shù)/妊娠并分娩的雌鼠只數(shù))以評(píng)估雌鼠的生育力。分別稱量各組雌鼠所產(chǎn)仔鼠體重以及測(cè)量初生仔鼠身長(zhǎng)。②仔鼠出生當(dāng)天每窩隨機(jī)取1--2只仔鼠斷頭取全腦,稱取全腦濕重,計(jì)算各組仔鼠全腦濕重的平均值及腦重指數(shù)(腦重指數(shù)=全腦濕重mg/鼠體重g),然后將全腦固定,切取包含皮質(zhì)的腦片,行光鏡和電鏡觀察。③雌鼠分娩后,在仔鼠出生當(dāng)天斷頭取血,用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清FT3、FT4、TSH的含量。④用免疫組化法檢測(cè)恐傷孕鼠對(duì)其仔鼠大腦Reelin、VLDLR及P-DAB1表達(dá)影響。⑤用RT-PCR法檢測(cè)恐傷孕鼠對(duì)仔鼠大腦皮質(zhì)Reelin、VLDLR及ApoER2的mRNA表達(dá)影響。結(jié)果①模型組孕鼠每胎生產(chǎn)數(shù)比正常組和補(bǔ)腎組明顯低(P0.01)。模型組仔鼠出生當(dāng)天體重及身長(zhǎng)與正常組和補(bǔ)腎組比較,有顯著性差異(P0.05)。②模型組仔鼠全腦濕重低于正常組和補(bǔ)腎組,模型組與正常組比較有顯著性差異(P0.05),正常組與補(bǔ)腎組仔鼠全腦濕重相比無明顯改變;仔鼠大腦組織包括皮質(zhì)區(qū)的形態(tài)學(xué)改變:模型組仔鼠大腦皮質(zhì)區(qū)光鏡下可見細(xì)胞較松散,組織結(jié)構(gòu)較模糊,存在散在片狀水腫,水腫區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目減少。電鏡下模型組仔鼠大腦皮質(zhì)區(qū)可見到多數(shù)神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞器結(jié)構(gòu)異常,部分伴有細(xì)胞核固縮。正常組與補(bǔ)腎組仔鼠形態(tài)學(xué)相比無明顯改變。③正常組、模型組和補(bǔ)腎組三組血清FT3、TSH的含量比較,其結(jié)果無顯著性差異;模型組與正常組和補(bǔ)腎組比較,血清FT4的含量顯著降低(P0.05)。④正常組仔鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞中Reelin、VLDLR及P-DAB1蛋白表達(dá)最強(qiáng);補(bǔ)腎組仔鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞Reelin、VLDLR及P-DAB1蛋白表達(dá)有所減弱;模型組仔鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞中Reelin、VLDLR及P-DAB1蛋白表達(dá)最弱;與正常對(duì)照組比較,補(bǔ)腎組和模型組仔鼠大腦皮質(zhì)Reelin、VLDLR及P-DAB1平均灰度值明顯降低(P0.01);與模型組比較,補(bǔ)腎組仔鼠大腦皮質(zhì)Reelin、VLDLR及P-DAB1的平均灰度值明顯升高(P0.01)。⑤補(bǔ)腎組和模型組仔鼠大腦皮質(zhì)Reelin、VLDLR及ApoER2mRNA表達(dá)均低于正常組(P0.01),模型組仔鼠大腦皮質(zhì)Reelin、VLDLR及ApoER2mRNA表達(dá)低于補(bǔ)腎組(P0.01)。結(jié)論本課題首次提出了“Reelin蛋白影響先天腎虛仔鼠大腦皮質(zhì)發(fā)育”的觀點(diǎn),并從中醫(yī)學(xué)角度深入闡述探討腎對(duì)腦的結(jié)構(gòu)和功能影響,以及Reelin蛋白與腦發(fā)育的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用運(yùn)用恐嚇為主的復(fù)合應(yīng)激法刺激方法成功復(fù)制出腎精虧虛模型,通過一般情況觀察,我們發(fā)現(xiàn)模型組仔鼠具有先天腎虛的表現(xiàn);通過顯微鏡下觀察我們發(fā)現(xiàn)模型組仔鼠大腦皮質(zhì)發(fā)育存在明顯的障礙,出現(xiàn)一系列諸如大腦皮質(zhì)腦細(xì)胞的高爾基復(fù)合體肥大,細(xì)胞核核周水腫、固縮、染色質(zhì)凝集、線粒體腫脹等病理改變。補(bǔ)腎組仔鼠大腦皮質(zhì)在光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡下的變化與正常組仔鼠基本一致。表明中藥左歸丸方可有效阻斷先天腎虛對(duì)腦皮質(zhì)發(fā)育的影響。模型組仔鼠出現(xiàn)大腦皮質(zhì)細(xì)胞中Reelin、VLDLR及P-DAB1蛋白表達(dá)下調(diào),Reelin、VLDLR及ApoER2mRNA表達(dá)下調(diào),血清TH含量顯著下降。據(jù)此,我們推測(cè)Reelin信號(hào)通路和TH含量顯著下降是先天腎虛仔鼠大腦發(fā)育障礙的重要環(huán)節(jié)。左歸丸可以通過調(diào)節(jié)Reelin信號(hào)通路和TH含量而阻斷仔鼠大腦皮質(zhì)發(fā)育障礙。
【學(xué)位授予單位】：湖北中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R285.5
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本文編號(hào)：1295333