本文關(guān)鍵詞：橄欖苦苷和異葒草苷對膠質(zhì)瘤的抑制作用及其機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 膠質(zhì)瘤 橄欖苦苷 異葒草苷 STAT3 beta-catenin miRNA

【摘要】：背景：膠質(zhì)瘤是成年人最常見的顱內(nèi)原發(fā)性惡性腫瘤,盡管在過去的幾十年中,膠質(zhì)瘤的治療在放化療和手術(shù)方面取得了很大進(jìn)展,然而其中位生存期仍然只有12-14個月。膠質(zhì)瘤患者預(yù)后差和死亡率高的主要原因是膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有很強(qiáng)的局部侵襲和遷移能力,從而導(dǎo)致手術(shù)不能將其完全切除,復(fù)發(fā)率高。另外,膠質(zhì)瘤細(xì)胞能夠招募并誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中的非腫瘤細(xì)胞促進(jìn)膠質(zhì)瘤進(jìn)展。在膠質(zhì)瘤微環(huán)境中,巨噬細(xì)胞是膠質(zhì)瘤細(xì)胞招募的主要免疫細(xì)胞之一。最近研究表明,膠質(zhì)瘤組織內(nèi)巨噬細(xì)胞的數(shù)量與膠質(zhì)瘤進(jìn)展呈正相關(guān)。上述問題表明,找到能夠針對膠質(zhì)瘤細(xì)胞和膠質(zhì)瘤微環(huán)境的治療方法將對膠質(zhì)瘤的治療提供幫助。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中含量最豐富的免疫細(xì)胞,占膠質(zhì)瘤微環(huán)境中非腫瘤細(xì)胞總數(shù)的10%左右。巨噬細(xì)胞活化有兩種主要途徑：巨噬細(xì)胞活化的經(jīng)典途徑(也被稱為M1)和替代途徑(也被稱為M2)。經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞(也被稱為M1巨噬細(xì)胞)由IFN-y和Toll樣受體(TLR)激動劑如LPS誘導(dǎo),高表達(dá)MHC Ⅱ類分子和CD86分子,并分泌大量的TNF-α,IL-6和NO。替代途徑激活的巨噬細(xì)胞(又稱M2巨噬細(xì)胞)由Th2細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子IL-4和IL-13誘導(dǎo),低表達(dá)MHC Ⅱ和CD86分子,可釋放大量抗炎因子如IL-10和TGF-p。研究表明,在惡性膠質(zhì)瘤組織內(nèi)分布的巨噬細(xì)胞主要為M2亞型,M2型巨噬細(xì)胞的數(shù)量與膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后不良相關(guān)。橄欖苦苷(Oleuropein)是一種從橄欖樹中提取的主要酚類成分之一,在多種腫瘤包括乳腺癌、甲狀腺癌,大腸癌和前列腺癌顯示出一定抗癌活性。另外,研究表明,腫瘤細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路如NF-κB, PI3K-Akt, MAPK和HIF-1 α通路與橄欖苦苷的抗癌活性相關(guān)。在膠質(zhì)瘤方面,Gulcin Tezcan等研究表明橄欖葉的提取物(Olea europaealeaf extract)能夠抑制膠質(zhì)瘤的增殖,盡管橄欖苦苷是橄欖葉的提取物的主要成分之一,然而,關(guān)于橄欖苦苷對人腦膠質(zhì)瘤的作用及其機(jī)制仍然未有研究。異葒草苷(3,4',5,7-tetrahydroxy-6-C-glucopyranosyl flavone, Isoorientin,ISO),是人類飲食中較為常見的一種C-糖基黃酮類物質(zhì),存在于某些植物如海芋、毛竹、千屈菜、蕎麥、敗醬草等[3-8]。最近多項研究表明,ISO具有多種藥理作用,如抗炎、抗氧化、抗菌和治療疼痛等[9-12]。另外,一些研究表明ISO也具有潛在的抗腫瘤活性[13-15]。然而,ISO對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用及其作用機(jī)制尚不明確。目的：1.橄欖苦苷對膠質(zhì)瘤的抑制作用及其機(jī)制研究：(1)研究橄欖苦苷對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響。(2)研究橄欖苦苷對膠質(zhì)瘤介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞遷移和M2極化的影響。(3)研究橄欖苦苷對膠質(zhì)瘤STAT3通路的作用。(4)研究橄欖苦苷對膠質(zhì)瘤STAT3通路下游基因(IL-6、IL-8、miR-21和miR-18lb)的作用。2.異葒草苷對膠質(zhì)瘤的抑制作用及其機(jī)制研究：(1)研究異葒草苷對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響。(2)研究異葒草苷對膠質(zhì)瘤Wnt/beta-catenin的作用。(3)研究異葒草苷對膠質(zhì)瘤miR-23a表達(dá)的作用。(4)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中研究miR-23a對Wnt/beta-catenin信號通路的調(diào)控。方法：1.橄欖苦苷對膠質(zhì)瘤的抑制作用及其機(jī)制研究：(1)以U87和U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞作為研究對象,采用MTT和BrdU內(nèi)吞實驗檢測橄欖苦苷對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響。(2)以THP1單核細(xì)胞為研究對象,采用Transwell細(xì)胞遷移試驗檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞招募膠質(zhì)瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的能力,研究橄欖苦苷對膠質(zhì)瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞向膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的影響。(3)以THPl單核細(xì)胞分化的巨噬細(xì)胞為研究對象,ELISA技術(shù)檢測巨噬細(xì)胞上清IL-10含量,、Vestern-Blot技術(shù)檢測巨噬細(xì)胞內(nèi)STAT3、p-STAT3水平,免疫熒光技術(shù)檢測巨噬細(xì)胞CD163表達(dá)水平,研究橄欖苦苷對膠質(zhì)瘤介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞向M2型極化的影響。(4)以U87和U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞作為研究對象,Vestern-Blot技術(shù)檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)STAT3、p-STAT3表達(dá)水平,ELISA技術(shù)檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞上清IL-6、IL-8含量,RT-PCR技術(shù)檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)miR-21和miR-181b表達(dá)水平,研究橄欖苦苷對膠質(zhì)瘤STAT3通路及其下游基因的作用。(5)以四周齡的BALB/c裸鼠為研究對象,將100μL細(xì)胞溶液(含有5×106U25l膠質(zhì)瘤細(xì)胞)皮下注射到小鼠的右側(cè),當(dāng)腫瘤長到平均約50-100立方毫米大小時,將造模成功的小鼠隨機(jī)分為兩組：橄欖苦苷作用組和對照組,每組5只,給藥方式為口服,劑量為5OOmg/kg/day,每周給藥5次,連續(xù)給藥4周,對照組給予生理鹽水。每7天測量一次腫瘤體積,腫瘤體積的計算公式：V=0.52×[L×W2],=體積,L=長度,W=寬度)。四周后將腫瘤組織取下,免疫組化檢測腫瘤組織內(nèi)CD163陽性細(xì)胞(腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞)數(shù)量,Western-Blot技術(shù)檢測STAT3、p-STAT3表達(dá)水平,RT-PCR技術(shù)檢測膠質(zhì)瘤組織內(nèi)miR-21和niR-181b表達(dá)水平。2.異葒草苷對膠質(zhì)瘤的抑制作用及其機(jī)制研究：(1)以U87和U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞作為研究對象,采用MTT和 BrdU內(nèi)吞實驗檢測異葒草苷對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響。(2)以U87和U25l膠質(zhì)瘤細(xì)胞作為研究對象,Vestern-Blot技術(shù)檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞總beta-catenin和核內(nèi)beta-catenin蛋白的表達(dá)情況,RT-PCR技術(shù)檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)niR-23a表達(dá)水平,研究異葒草苷對膠質(zhì)瘤Wnt/beta-catenin通路及miR-23a的作用。(3)利用轉(zhuǎn)染試劑將miR-23a抑制劑或其陰性對照轉(zhuǎn)染到膠質(zhì)瘤細(xì)胞,研究niR-23a對膠質(zhì)瘤Wnt/beta-catenin通路的調(diào)控。(4)利用皮下種植裸鼠膠質(zhì)瘤動物模型檢測異葒草苷是否影響體內(nèi)膠質(zhì)瘤的生長,并將腫瘤組織取下Western-Blot技術(shù)檢測總beta-catenin和核內(nèi)beta-catenin蛋白的表達(dá)情況,RT-PCR技術(shù)檢測miR-23a表達(dá)水平。結(jié)果：1.橄欖苦苷對膠質(zhì)瘤的抑制作用及其機(jī)制研究(1)MTT結(jié)果顯示：橄欖苦苷對U87和U25l細(xì)胞存活的抑制具有時間和劑量依賴性。BrdU內(nèi)吞實驗結(jié)果顯示：橄欖苦苷治療明顯抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。(2)Transwell遷移試驗結(jié)果顯示：橄欖苦苷明顯抑制巨噬細(xì)胞向膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移。(3)橄欖苦苷抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化。1) ELISA結(jié)果顯示：與對照組(不加橄欖苦苷)相比較,加入橄欖苦苷的膠質(zhì)瘤細(xì)胞上清液能夠抑制THP1細(xì)胞分化的巨噬細(xì)胞分泌IL-10。2) Western Blot結(jié)果顯示：與對照組(不加橄欖苦苷)相比較,加入橄欖苦苷組巨噬細(xì)胞內(nèi)p-STAT3水平較低,而STAT3表達(dá)水平無明顯變化。3)免疫熒光結(jié)果顯示：與對照組(不加橄欖苦苷)相比較,加入橄欖苦苷組巨噬細(xì)胞CD163陽性率較低。(4)橄欖苦苷抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞STAT3信號通路。1) Western-Blot結(jié)果顯示：與對照組(不加橄欖苦苷)相比較,橄欖苦苷明顯抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞STAT3和p-STAT3表達(dá)水平。2) ELISA結(jié)果顯示：與對照組(不加橄欖苦苷)相比較,橄欖苦苷明顯抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞IL-6和IL-8表達(dá)水平。3) RT-PCR結(jié)果顯示：與對照組(不加橄欖苦苷)相比較,橄欖苦苷明顯抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞miR-21表達(dá),而miR-181b表達(dá)水平無明顯變化。(5)體內(nèi)驗證橄欖苦苷對膠質(zhì)瘤的抑制作用。1)給予橄欖苦苷治療組膠質(zhì)瘤的生長速度明顯降低。2)免疫組化分析結(jié)果表明,橄欖苦苷治療明顯抑制膠質(zhì)瘤組織內(nèi)CD163陽性細(xì)胞(M2型巨噬細(xì)胞)的浸潤。3)RT-PCR分析結(jié)果表明,橄欖苦苷治療明顯抑制膠質(zhì)瘤組織miR-21表達(dá),而miR-181b表達(dá)水平無明顯變化。4) Western-Blot技術(shù)分析證實,橄欖苦苷治療明顯抑制膠質(zhì)瘤組織STAT3和磷酸化STAT3水平。2.異葒草苷對膠質(zhì)瘤的抑制作用及其機(jī)制研究：(1)MTT結(jié)果顯示：異葒草苷對U87和U251細(xì)胞存活的抑制具有時間和劑量依賴性。BrdU內(nèi)吞實驗結(jié)果顯示：橄欖苦苷治療明顯抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。(2) Western-Blot結(jié)果顯示：與對照組(不加異葒草苷)相比較,加入異葒草苷組膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)總beta-catenin和核內(nèi)beta-catenin蛋白的表達(dá)水平較低。RT-PCR結(jié)果顯示：與對照組(不加異葒草苷)相比較,異葒草苷明顯抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞niR-23a表達(dá)。(3) Western-Blot結(jié)果顯示：與對照組相比較,miR-23a抑制組膠質(zhì)瘤細(xì)胞總beta-catenin和核內(nèi)beta-catenin蛋白的表達(dá)水平較低。(4)體內(nèi)驗證異葒草苷對膠質(zhì)瘤的抑制作用。1)給予異葒草苷治療組膠質(zhì)瘤的生長速度明顯降低。2) Western-Blot技術(shù)分析證實,異葒草苷治療明顯抑制膠質(zhì)瘤組織總beta-catenin和核內(nèi)beta-catenin蛋白的表達(dá)水平。3)RT-PCR分析結(jié)果表明,異葒草苷治療明顯抑制膠質(zhì)瘤組織miR-23a表達(dá)。結(jié)論：通過體內(nèi)外實驗,我們發(fā)現(xiàn)橄欖苦苷可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖,抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞遷移和M2極化；STAT3信號通路以及其下游基因IL-6、IL-8和miR-21與橄欖苦苷的抑制膠質(zhì)瘤作用有關(guān)。另外,我們發(fā)現(xiàn)異葒草苷可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖；Wnt/beta-catenin信號通路與異葒草苷的抑制膠質(zhì)瘤作用有關(guān)；miR-23a可以在膠質(zhì)瘤細(xì)胞調(diào)控Wnt/beta-catenin信號通路的活性；異葒草苷通過抑制miR-23a表達(dá)抑制Wnt/beta-catenin信號通路的活性。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R273

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 吳鳴建,董建軍,張海艷,郭唯,趙天增;小葉丁香組織培養(yǎng)生成橄欖苦苷(Ⅰ)[J];中草藥;2005年04期

2 黨建章;黃志立;張志安;馮麗雄;頓曉東;;橄欖葉中橄欖苦苷不同提取方法的研究[J];深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報;2006年04期

3 游雙銀;尹衛(wèi)平;張麗;王忠東;;聚酰胺膜在橄欖苦苷分離上的工藝研究[J];中成藥;2007年08期

4 郝婷;崔建玲;趙桂琴;張樹峰;;橄欖苦苷提取分離和藥理活性的研究進(jìn)展[J];承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2010年01期

5 鄧瑞雪;劉普;袁華;趙尤曼;段文錄;尹衛(wèi)平;;小葉丁香中橄欖苦苷的純化工藝研究[J];食品科學(xué);2010年08期

6 傅珊;萬文倩;楊文革;胡永紅;;油橄欖葉中橄欖苦苷的分離純化[J];生物加工過程;2011年04期

7 閆樹軍;王遠(yuǎn);蘇艷紅;饒在生;李暉;;響應(yīng)面法優(yōu)化油橄欖葉中橄欖苦苷超聲輔助提取工藝[J];食品科學(xué);2012年18期

8 黃麗紅;;橄欖苦苷的抗結(jié)腸癌作用機(jī)制[J];中華普通外科學(xué)文獻(xiàn)(電子版);2013年05期

9 尹營松;蘇占輝;劉麗艷;趙桂琴;陳四平;;橄欖苦苷在大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)研究[J];時珍國醫(yī)國藥;2012年08期

10 王守旭;宋杏花;鄧艷;徐曉燕;;從油橄欖葉中提取并純化橄欖苦苷的工藝方法探討[J];求醫(yī)問藥(下半月);2012年11期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 黨建章;張幸生;黃曉裕;馮麗雄;;D-101大孔樹脂富集橄欖葉中橄欖苦苷的研究[A];2006第六屆中國藥學(xué)會學(xué)術(shù)年會論文集[C];2006年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 李連陵;橄欖苦苷和異葒草苷對膠質(zhì)瘤的抑制作用及其機(jī)制研究[D];山東大學(xué);2015年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 尹營松;橄欖苦苷大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)研究[D];承德醫(yī)學(xué)院;2012年

2 劉飛飛;裂環(huán)環(huán)烯醚萜型化合物橄欖苦苷的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物研究[D];云南中醫(yī)學(xué)院;2015年

3 林培燕;毛冬青活性成分及其藥代動力學(xué)研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

4 鄭媛媛;油橄欖葉中橄欖苦苷和黃酮含量測定方法研究[D];蘭州大學(xué);2011年

5 閆靜;抗病毒活性糖苷的篩選及其對TLR3及相關(guān)基因的調(diào)控[D];吉林大學(xué);2014年

6 韓晶;紫丁香和炎立消化學(xué)成分研究[D];齊齊哈爾大學(xué);2012年

，

本文編號：1293418