本文關(guān)鍵詞：氯喹抑制NLRP3炎癥小體活化介導其抗炎效應的機制研究

  更多相關(guān)文章： NLRP3炎癥小體 氯喹 膿毒癥 IL-1β ATP1B3

【摘要】：研究背景與目的:膿毒癥是感染所致的一種臨床綜合征,主要表現(xiàn)為因宿主免疫應答失調(diào)引發(fā)的多器官功能紊亂。膿毒癥是臨床危重癥病人死亡的首要因素之一,但目前尚無可靠有效的防治藥物用于臨床治療。業(yè)已證實,機體內(nèi)過度的炎癥反應是導致膿毒癥發(fā)病和多器官功能紊亂的核心病理事件。因此,對炎癥反應的關(guān)鍵環(huán)節(jié)進行拮抗是膿毒癥藥物研發(fā)的重要方向。炎癥小體是近年來發(fā)現(xiàn)的新型炎癥調(diào)控平臺,在機體炎癥發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用,其中NLRP3炎癥小體是目前研究最為廣泛的炎癥小體類型。近來發(fā)現(xiàn),NLRP3的活化與膿毒癥的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。研究顯示多種誘發(fā)膿毒癥的重要病原體分子模式(PAMPs)都可在機內(nèi)體激活NLRP3炎癥小體,介導IL-1家族炎癥因子成熟釋放并導致免疫細胞焦亡等的發(fā)生,因此它的過度活化在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。NLRP3炎癥小體的活化過程包括蛋白組分轉(zhuǎn)錄表達和蛋白復合物裝配。PAMPs激活模式識別受體(PRRs)下游胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導途徑啟動蛋白組分的轉(zhuǎn)錄表達,又被稱為第一信號(signal 1),如LPS。LPS被細胞TLR4識別后激活NF-κB和MAPK信號通路啟動炎癥因子前體和NLRP3轉(zhuǎn)錄表達。其他激活因子啟動蛋白復合物裝配,被稱為是第二信號(signal 2),如ATP。第二信號調(diào)控NLRP3炎癥小體復合物裝配的具體分子機制尚不清楚,但近來鉀離子外流模型得到更多的認可,ATP促進胞內(nèi)鉀離子外流介導NLRP3、ASC和caspase-1組裝成蛋白嵌合體,激活炎癥小體下游效應。氯喹最早作為抗瘧疾藥物廣泛應用于臨床,近年來在類風濕性關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫疾病中也有應用。我們課題組最先報道了氯喹對膿毒癥模型小鼠的保護作用,且發(fā)現(xiàn)該作用與其介導的TLR4通路的抗炎效應密切相關(guān)。在后續(xù)研究中,我們還發(fā)現(xiàn)氯喹通過影響蛋白泛素化系統(tǒng)抑制其炎癥效應,提示氯喹可能存在多重的抗炎機制。氯喹對膿毒癥模型小鼠的保護作用是否與NLRP3炎癥小體活化有關(guān),具體分子機制是與signal1還是signal2有關(guān),目前均不清楚,也無相關(guān)文獻報道。因此,本課題首先在膿毒癥動物模型中展開氯喹對NLRP3活化的效應研究。進而在體外建立巨噬細胞NLRP3炎癥小體激活模型,從轉(zhuǎn)錄起始和裝配調(diào)控層面研究其調(diào)控NLRP3炎癥小體活化的分子機制。最終明確氯喹調(diào)控NLRP3炎癥小體活化的作用和分子機制,為擴大氯喹的適應癥提供實驗依據(jù),也為基于炎癥小體抑制作用的抗膿毒癥藥物研究提供新思路。方法:1.氯喹體內(nèi)抑制NLRP3炎癥小體活化及其介導膿毒癥模型小鼠保護效應的作用研究1.1通過對BABL/c小鼠尾靜脈注射內(nèi)毒素建立死亡率高于70%的膿毒癥動物模型。腹腔給藥的方式給予30mg/kg或10mg/kg劑量的氯喹,觀察記錄模型小鼠的7天生存情況。分別在LPS攻擊6h和24h后采集小鼠外周血,檢測血液中ALT和AST水平;在相同時相點獲取小鼠肝、脾、肺等組織進行HE染色觀察藥物對LPS介導的臟器損傷的影響,明確藥物對模型動物的保護作用。1.2在1.1建立的模型動物基礎上,給藥30mg/kg劑量的氯喹,分別于LPS攻擊后6h、12h和24h采集小鼠外周血和腹腔灌洗液。ELISA檢測外周血中IL-1β和IL-18釋放水平。同時獲取小鼠肝、脾和肺等組織進行組織勻漿,檢測勻漿液中IL-1β和IL-18蛋白水平,capase-1活化水平和NLRP3蛋白表達水平,明確氯喹對NLRP3炎癥小體活化及其下游效應的作用。2.氯喹抑制NLRP3炎癥小體活化的作用機制研究2.1體外分離誘導骨髓源巨噬細胞(BMDMs),激光共聚焦和流式細胞儀檢測F4/80陽性細胞率;通過LPS和ATP刺激建立體外LPS介導的NLRP3炎癥小體激活細胞模型;不同劑量氯喹處理細胞后檢測細胞上清中IL-1β和IL-18釋放水平;蛋白免疫印跡法(WB)檢測藥物作用后細胞裂解液和細胞上清中的ASC、caspase-1前體和caspase-1 p10表達水平;不同ATP作用時相點藥物影響細胞LDH釋放率;檢測藥物抑制其它NLRP3炎癥小體激活因子促進IL-1β釋放的影響;在腹腔巨噬細胞系中觀察藥物對IL-1β釋放的影響;明確氯喹對LPS和ATP介導的巨噬細胞NLRP3炎癥小體活化的作用。2.2 ELISA檢測氯喹對細胞內(nèi)IL-1β和IL-18前體表達水平和細胞上清中的成熟釋放水平的影響;RT-q PCR檢測氯喹影響LPS介導的IL-1β和IL-18的轉(zhuǎn)錄水平;進一步檢測氯喹對NLRP3基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平的影響;明確氯喹對NLRP3炎癥小體活化信號一通路的作用。WB檢測氯喹影響LPS介導的NF-κB p65磷酸化水平、IκBα磷酸化水平和IκBα總蛋白降解降解水平;激光共聚焦觀察NF-κB p65核轉(zhuǎn)位情況;WB檢測氯喹影響MAPK通路中ERK、P38和JNK的激活水平;明確氯喹作用于炎癥小體蛋白組分轉(zhuǎn)錄從而調(diào)控NLRP3炎癥小體活化的分子機制。2.3改變氯喹作用階段或洗滌細胞去除藥物后檢測IL-1β釋放變化;激光共聚焦觀察免疫熒光標記的ASC蛋白在胞內(nèi)形成ASC specks,計算ASC specks陽性細胞百分率;不同濃度鉀離子影響氯喹抑制IL-1β釋放,檢測氯喹影響胞內(nèi)鉀離子濃度,比較氯喹對鉀離子外流效應的影響,明確氯喹通過影響蛋白復合物裝配調(diào)控NLRP3炎癥小體活化。Affymetrix基因表達譜芯片檢測氯喹影響LPS介導的巨噬細胞活化的差異表達基因;GO富集分析鉀離子代謝相關(guān)的差異表達基因;RT-q PCR和WB檢測氯喹影響ATP1B3的基因表達水平和蛋白表達水平;WB檢測si ATP1B3-1、si ATP1B3-2、si ATP1B3-3干擾后ATP1B3蛋白表達水平,確認si RNA對ATP1B3蛋白表達干擾作用;si ATP1B3后對LPS和ATP激活的NLRP3炎癥小體的下游效應的影響;檢測si ATP1B3后細胞IL-1β釋放、caspase-1激活水平,確認氯喹通過ATP1B3影響NLRP3炎癥小體活化的作用。結(jié)果:1.氯喹體內(nèi)抑制NLRP3炎癥小體活化及其介導膿毒癥模型小鼠保護效應的作用研究1.1模型組小鼠7天生存率低于30%,30mg/kg氯喹顯著提高模型組小鼠生存率(p=0.0155);模型組小鼠肺組織出現(xiàn)可見彌漫性出血、水腫,伴有散在炎細胞侵潤,氯喹明顯減輕該效應;氯喹顯著抑制模型動物體內(nèi)升高的血清ALT和AST;表明氯喹減輕模型動物器官損傷,提高膿毒癥模型小鼠生存率。1.2血清學檢測結(jié)果顯示,模型組在6h、12h和24h的IL-1β和IL-18顯著高于生理鹽水對照組,氯喹顯著抑制IL-1β和IL-18釋放;同時,在腹腔灌洗液中檢測到與血清學相似效應;在肝臟和肺組織中均檢測到模型組小鼠IL-1β和IL-18水平顯著上調(diào),氯喹對該上調(diào)效應有顯著抑制作用;WB檢測結(jié)果顯示氯喹顯著抑制LPS攻擊引起的caspase-1激活;同時,在組織中還發(fā)現(xiàn)氯喹抑制模型組的NLRP3蛋白表達水平上調(diào)。表明氯喹抑制體內(nèi)NLRP3炎癥小體激活及其下游效應。2.氯喹抑制NLRP3炎癥小體活化的作用機制研究2.1體外分離誘導獲得純度較高的BMDMs中,氯喹劑量-效應依賴性抑制LPS和ATP介導的巨噬細胞IL-1β和IL-18釋放;WB檢測結(jié)果顯示LPS和ATP激活caspase-1p10生成,氯喹顯著抑制該作用且不影響caspase-1前體和ASC蛋白表達;LPS和ATP介導細胞LDH快速釋放,氯喹顯著抑制該效應;氯喹能夠抑制nigericin介導的IL-1β成熟釋放;在腹腔巨噬細胞中也觀察氯喹具有相似的作用,表明氯喹下調(diào)巨噬細胞NLRP3炎癥小體活化,減少IL-1β和IL-18成熟釋放,抑制細胞焦亡。2.2細胞內(nèi)蛋白水平檢測結(jié)果提示氯喹抑制IL-1β和IL-18前體表達水平,通過RT-q PCR檢測確定氯喹通過抑制IL-1β和IL-18轉(zhuǎn)錄降低前體的表達;同時氯喹通過抑制Nlrp3轉(zhuǎn)錄水平降低NLRP3表達。LPS上調(diào)NF-κB p65(ser536)和IκBα蛋白磷酸化水平,促進IκBα蛋白降解,從而激活巨噬細胞內(nèi)NF-κB信號通路,氯喹對NF-κB信號通路具有抑制效應;LPS明顯增強NF-κB p65核轉(zhuǎn)位效應,氯喹明顯抑制NF-κB p65核轉(zhuǎn)位水平;另外氯喹抑制MAPK信號通路的ERK、JNK和p38的磷酸化激活水平。上述結(jié)果表明氯喹通過抑制NF-κB和MAPK信號通路抑制NLRP3蛋白組分的轉(zhuǎn)錄水平,從而負調(diào)控NLRP3炎癥小體活化。2.3細胞外IL-1β和IL-18水平檢測結(jié)果提示氯喹顯著IL-1β和IL-18的剪切成熟;在不同激活階段、細胞洗滌去除藥物作用后檢測IL-1β釋放水平,結(jié)果顯示氯喹對NLRP3炎癥小體激活相關(guān)的轉(zhuǎn)錄啟動和蛋白裝配信號通路都有抑制作用;高濃度的鉀離子顯著增強氯喹的抑制效應;相較于LPS+ATP組,氯喹胞內(nèi)鉀離子濃度顯著升高,提示氯喹顯著抑制鉀離子外流;表明氯喹同時抑制signal 2信號活化的NLRP3炎癥小體。Affymetrix表達譜芯片結(jié)果中的鉀離子代謝相關(guān)差異表達基因進行GO富集結(jié)果顯示,氯喹上調(diào)ATP1B3基因表達水平;進一步驗證發(fā)現(xiàn)氯喹相較于LPS組顯著上調(diào)ATP1B3的m RNA水平和蛋白表達水平;si RNA有效干擾細胞內(nèi)ATP1B3蛋白表達后,顯著上調(diào)LPS和ATP介導的NLRP3炎癥小體激活的下游效應;ATP1B3表達被干擾后,氯喹對NLRP3炎癥小體活化的抑制效應顯著減弱。表明氯喹上調(diào)ATP1B3,抑制鉀離子外流,進而抑制NLRP3炎癥小體的裝配。結(jié)論:1.氯喹體內(nèi)能夠抑制NLRP3炎癥小體活化,降低IL-1家族炎癥因子成熟,進而發(fā)揮對膿毒癥模型小鼠的保護作用。2.氯喹在體外抑制LPS和ATP介導的巨噬細胞NLRP3炎癥小體激活,減少IL-1β和IL-18的成熟釋放,抑制細胞焦亡的發(fā)生。3.氯喹通過抑制炎癥小體蛋白組分的轉(zhuǎn)錄起始和復合物裝配兩個信號通路負調(diào)控NLRP3炎癥小體活化。氯喹通過MAPK和NF-k B信號通路抑制NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)錄表達。氯喹還可上調(diào)ATP1B3的表達,抑制鉀離子外流,從而負調(diào)控NLRP3炎癥小體復合物裝配。
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R96

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 曾朝陽;張穎;鄒雪琴;;NLRP3炎性體與白細胞介素-1β在2型糖尿病中的作用[J];中國老年學雜志;2013年11期

2 王振磊;孫萍萍;李天曉;黎曙霞;;白頭翁湯激活NLRP3炎癥小體治療炎癥性腸病的研究[J];中藥材;2012年08期

3 鈕憶欣;蘇青;;NLRP3的炎性反應在2型糖尿病中的作用[J];醫(yī)學綜述;2011年02期

4 宋智;姜瀾;林正梅;;NLRP3及其在口腔疾病中的研究進展[J];中華口腔醫(yī)學研究雜志(電子版);2012年05期

5 毛開睿;孫兵;;NLRP3炎癥小體研究進展[J];現(xiàn)代免疫學;2011年01期

6 王定坤;陳廣;陸付耳;;NLRP3炎癥小體與2型糖尿病的研究進展[J];生理科學進展;2014年02期

7 隋永恒;連敏;華靜;;體內(nèi)外高脂對肝臟NLRP3炎性小體相關(guān)基因表達的影響[J];胃腸病學;2014年01期

8 張懿;劉磊;劉韻資;張婷;蔣春雷;;NLRP3炎性小體研究新進展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學進展;2014年09期

9 蔣建燁;田nI;張艷;;NLRP3炎癥體與炎癥性疾病[J];微生物學免疫學進展;2012年01期

10 宋麗敏;尚游;吳艷;;NLRP3炎性小體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥中的作用[J];中風與神經(jīng)疾病雜志;2014年04期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 鐘琳曄;楊汀;;NLRP3炎癥小體及其激活產(chǎn)物在慢性阻塞性肺疾病中的作用研究進展[A];中華醫(yī)學會呼吸病學年會——2013第十四次全國呼吸病學學術(shù)會議論文匯編[C];2013年

2 王振磊;孫萍萍;李天曉;黎曙霞;;白頭翁湯激活NLRP3炎癥小體治療炎癥性腸病的研究[A];2013年廣東省藥師周大會論文集[C];2013年

3 黃馨;軒東英;章錦才;;NLRP3信號通路在牙周炎與糖尿病相互關(guān)系中的研究[A];第十次全國牙周病學學術(shù)會議論文摘要匯編[C];2014年

4 王彥君;龔國清;陳建軍;陳刪;牛永芝;熊利燕;孔維佳;;慢性鼻竇炎伴與不伴鼻息肉與NLRP3炎癥小體的關(guān)系[A];中華醫(yī)學會第十三次全國耳鼻咽喉——頭頸外科學術(shù)會議論文匯編[C];2013年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 陳曉麗;氯喹抑制NLRP3炎癥小體活化介導其抗炎效應的機制研究[D];第三軍醫(yī)大學;2017年

2 曹正旺;NLRP3炎癥小體在重金屬毒物暴露致炎癥反應中的作用及機制研究[D];第三軍醫(yī)大學;2017年

3 王玢tx;新城疫病毒激活NLRP3炎癥小體及其作用[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2016年

4 孔祥;NLRP3炎癥小體在糖化終末產(chǎn)物誘導的胰島β細胞損傷中的作用研究[D];上海交通大學;2015年

5 肖孟景;NLRP3炎性體在深二度燒傷創(chuàng)面早期加深中的作用及自噬對其的調(diào)控[D];中國人民解放軍醫(yī)學院;2016年

6 潘楊;NLRP3炎癥小體在帕金森病神經(jīng)炎癥中的作用及治療學意義研究[D];南京醫(yī)科大學;2016年

7 張懿;NLRP3炎性小體在抑郁樣行為中的作用及分子機制[D];第二軍醫(yī)大學;2016年

8 劉海亮;抑制NLRP3炎性體聯(lián)合CIK細胞治療胰腺癌的實驗研究[D];中國人民解放軍醫(yī)學院;2016年

9 余琛琳;基于NLRP3炎癥小體的無煙氣煙草水提取物的肝臟毒性作用及機制研究[D];第二軍醫(yī)大學;2016年

10 謝強;miR-223抑制佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠巨噬細胞NLRP3炎癥小體介導炎癥因子分泌的分子機制研究[D];安徽醫(yī)科大學;2016年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 謝海龍;2型糖尿病患者外周血單個核細胞NLRP3炎性體mRNA表達和炎性因子水平與動脈粥樣硬化相關(guān)性研究[D];長江大學;2015年

2 沈文文;miR-20a對AA大鼠模型滑膜細胞中NLRP3炎癥小體的調(diào)控作用及其機制的研究[D];安徽醫(yī)科大學;2015年

3 徐曉艷;TIM-4與2型糖尿病的相關(guān)性及對NLRP3炎性體的抑制效應[D];山東大學;2015年

4 許倡濤;TXNIP介導的心肌微血管內(nèi)皮細胞NLRP3炎性小體活化在心肌缺血再灌注損傷中的機制研究[D];第四軍醫(yī)大學;2015年

5 魯理;1,25(OH)2D3通過抑制NLRP3炎癥小體激活保護高糖誘導的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞功能障礙[D];蚌埠醫(yī)學院;2015年

6 周航;小檗堿通過抑制NLRP3炎癥小體活化改善小鼠胰島素抵抗[D];南京大學;2014年

7 楊加偉;糖皮質(zhì)激素調(diào)控NLRP3炎性體表達在ALI/ARDS中的作用和機制[D];蘇州大學;2016年

8 尹聰聰;NLRP3炎癥小體信號通路基因多態(tài)性與骨髓增生異常綜合征易感性的關(guān)聯(lián)研究[D];山東大學;2016年

9 許鍵;NLRP3炎癥小體與心房顫動的相關(guān)性研究[D];廣西醫(yī)科大學;2016年

10 張維康;NLRP3炎癥復合體在呼吸機相關(guān)性肺損傷中的作用機制研究[D];廣西醫(yī)科大學;2016年

，

本文編號：1293322