本文關(guān)鍵詞：多烯磷脂酰膽堿聯(lián)合奧沙利鉑抗胃癌增殖作用的研究

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【摘要】：胃癌在我國(guó)發(fā)病率較高,嚴(yán)重危害著人民的生命健康�；熢谖赴┑木C合治療中占有很重要的地位,因此化療的有效率是影響胃癌患者預(yù)后的重要因素之一。奧沙利鉑(oxaliplatin,L-OHP)為鉑絡(luò)合物類抗癌藥物第三代衍生物,與順鉑無(wú)明顯交叉耐藥,廣泛用于治療胃腸道等消化系統(tǒng)來(lái)源的腫瘤,其作用機(jī)制為通過(guò)與DNA產(chǎn)生烷化絡(luò)合作用,進(jìn)而形成細(xì)胞內(nèi)DNA鏈內(nèi)和鏈間的交聯(lián),抑制惡性腫瘤細(xì)胞內(nèi)的DNA合成和復(fù)制。奧沙利鉑目前廣泛應(yīng)用于胃癌的術(shù)后輔助治療及晚期胃癌的多線化療,隨著臨床使用經(jīng)驗(yàn)的積累,發(fā)現(xiàn)奧沙利鉑導(dǎo)致的肝臟毒性也較為常見(jiàn)。由于目前有關(guān)奧沙利鉑誘發(fā)的肝臟功能損傷機(jī)制尚不十分明確,臨床工作中對(duì)于以?shī)W沙利鉑為基礎(chǔ)的化療是否常規(guī)使用護(hù)肝藥物或使用何種保肝藥物尚無(wú)定論多烯磷脂酰膽堿(Polyennephosphatidylcholine,PPC)是必需磷脂的主要活性成分之一,對(duì)細(xì)胞和亞細(xì)胞膜具有高效生物利用度和高度親和力,能夠以整個(gè)完整的分子與細(xì)胞膜或細(xì)胞器膜相結(jié)合,增加膜的穩(wěn)定性、流動(dòng)性和完整性,同時(shí)可以減少細(xì)胞的氧應(yīng)激與脂質(zhì)過(guò)氧化、降低細(xì)胞炎癥反應(yīng)和抑制細(xì)胞凋亡等各項(xiàng)作用。對(duì)于肝臟組織,可以通過(guò)增加肝膠原降解,阻止肝細(xì)胞中各組因素所致的線粒體異常,減輕肝纖維化。目前多烯磷脂酰膽堿是臨床中較為常用的一種保肝藥物,同時(shí)也是一種圍化療期處理化療性肝損傷的常用藥物。但是有關(guān)多烯磷脂酰膽堿對(duì)于奧沙利鉑抗腫瘤療效的影響,目前尚不清楚。目前含奧沙利鉑的化療方案已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床胃癌的治療中。盡管各種抗癌治療的發(fā)展取得了長(zhǎng)足進(jìn)步,但是胃癌治療中奧沙利鉑耐藥性日趨明顯,無(wú)論原發(fā)性耐藥或者繼發(fā)性耐藥,且成為抗腫瘤治療的主要瓶頸。探討奧沙利鉑耐藥機(jī)制已成為目前胃癌治療的關(guān)鍵問(wèn)題之一。有關(guān)奧沙利鉑在胃癌細(xì)胞耐藥機(jī)制十分復(fù)雜,目前尚不十分明確,涉及與腫瘤生長(zhǎng)的相關(guān)的微環(huán)境,細(xì)胞線粒體、細(xì)胞膜以及細(xì)胞蛋白質(zhì)和信號(hào)傳導(dǎo)等多種因素,目前,已經(jīng)有許多研究對(duì)這一現(xiàn)象及其機(jī)制進(jìn)行了探討。目前較為熱門(mén)主要集中在耐藥相關(guān)的ABC超家族蛋白以及腫瘤干細(xì)胞。對(duì)上述問(wèn)題,本課題擬通過(guò)兩部分內(nèi)容開(kāi)展:首先探討多烯磷脂酰膽堿對(duì)奧沙利鉑化療療效的影響,結(jié)果提示低濃度多烯磷脂酰膽堿可以與奧沙利鉑可產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤作用。在發(fā)現(xiàn)多烯磷脂酰膽堿可以與奧沙利鉑可產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤療效后,開(kāi)展第二部分研究,誘導(dǎo)胃癌奧沙利鉑耐藥胃癌細(xì)胞系,檢測(cè)其多項(xiàng)ABC超家族蛋白以及腫瘤干細(xì)胞蛋白表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)耐藥細(xì)胞Nanog及ABCF2的高表達(dá)。多烯磷脂酰膽堿作用于胃癌耐藥細(xì)胞后,結(jié)果發(fā)現(xiàn)耐藥細(xì)胞奧沙利鉑敏感指數(shù)明顯增高,同時(shí)Nanog與ABCF2的表達(dá)降低,提示多烯磷脂酰膽堿可以逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥細(xì)胞針對(duì)奧沙利鉑的耐藥。方法:1.細(xì)胞增殖檢測(cè)采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖指數(shù):實(shí)驗(yàn)分為單藥奧沙利鉑組,加入不同濃度(0-16 μg/ml)的奧沙利鉑100 μl;單藥多烯磷脂酰膽堿組,加入不同濃度(0-64μmol/L)多烯磷脂酰膽堿100μ1;繼續(xù)于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞24、48、72h后,分別在各孔中加入20 μlMTT后放室溫中繼續(xù)培養(yǎng)4h,然后行檢測(cè)。藥物聯(lián)合組,奧沙利鉑的濃度設(shè)定略低于48小時(shí)的IC50濃度3.5 μg/ml;多烯磷脂酰膽堿的濃度分別為0、2、4、8、16、32、64μmol/L。并將分組進(jìn)行命名(分別為Ⅰ,Ⅱ,Ⅲa,Ⅲb,Ⅲc,Ⅲd,Ⅲe,Ⅲf組)共同作用于胃癌細(xì)胞,繼續(xù)于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞48h后,分別在各孔中加入20μ lMTT后繼續(xù)培養(yǎng)4h,然后行檢測(cè)。觀察不同藥物不同濃度不同作用時(shí)間對(duì)于胃癌細(xì)胞增殖的影響。2.藥物合用指數(shù)針對(duì)聯(lián)合作用組計(jì)算兩者藥物合用指數(shù)。利用金氏公式Q=E(a+b)/(Ea+Eb-Ea×Eb)判斷奧沙利鉑與多烯磷脂酰膽堿的合并用藥指數(shù)(Q值),其中Ea代表不同濃度的奧沙利鉑對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制率,Eb代表不同濃度的多烯磷脂酰膽堿對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制率,E(a+b)為兩種藥物聯(lián)合使用對(duì)于胃癌細(xì)胞的抑制率(即實(shí)測(cè)合并效應(yīng)),Ea+Eb-Ea×Eb為期望產(chǎn)生的合并效應(yīng)。若Q值在0.85～1.15范圍內(nèi)表示兩藥合用療效為單純相加,Q值1.15為兩種藥物產(chǎn)生了協(xié)同作用,Q值0.85則表示兩種藥物產(chǎn)生了拮抗作用。3.細(xì)胞周期檢測(cè)檢測(cè)聯(lián)合作用組中各分組奧沙利鉑的濃度設(shè)3.5 μ g/ml;多烯磷脂酰膽堿的濃度分別為0、2、4、8、16、32、64 μmol/L,共同作用于胃癌細(xì)胞,繼續(xù)于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞48h,經(jīng)PI染色標(biāo)記后,用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析,計(jì)算SGC-7901細(xì)胞處于不同細(xì)胞周期的比例。4.細(xì)胞凋亡檢測(cè)檢測(cè)聯(lián)合作用組中各分組奧沙利鉑的濃度設(shè)3.5 μ g/ml;多烯磷脂酰膽堿的濃度分別為0、2、4、8、16、32、64μmol/L,共同作用于胃癌細(xì)胞,繼續(xù)于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞48h,經(jīng)V-FITC和PI標(biāo)記后,用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析,計(jì)算SGC-7901細(xì)胞處于不同細(xì)胞周期的比例。5.細(xì)胞周期相關(guān)蛋白檢測(cè)采用Westert blotting檢測(cè)方法,檢測(cè)聯(lián)合作用組中各分組細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1、Cyclin E 的表達(dá)情況。6.細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白檢測(cè)采用Western blotting檢測(cè)方法,檢測(cè)聯(lián)合作用組中各分組細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cytochrome c、Bax、Bcl-2、Bak、cleaved caspase-3、9 的表達(dá)情況。7.細(xì)胞活性氧(ROS)檢測(cè)通過(guò)超氧化物歧化酶活性(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性(GSH-Px)活性和丙二醛含量(MDA)評(píng)估聯(lián)合作用組中各分組細(xì)胞內(nèi)氧化和抗氧化狀態(tài),觀察ROS系統(tǒng)在聯(lián)合作用組之間功能的差別。8.耐藥細(xì)胞株的建立及其增殖活性本實(shí)驗(yàn)所采用的方法是逐步遞增細(xì)胞培養(yǎng)液中奧沙利鉑濃度、間歇作用于SGC-7901胃癌細(xì)胞,對(duì)其進(jìn)行體外誘導(dǎo)篩選而獲得。應(yīng)用MTT法分別檢測(cè)倍比稀釋濃度的奧沙利鉑對(duì)細(xì)胞的抑制率,進(jìn)而確認(rèn)所建義細(xì)胞系具有良好的耐藥性和穩(wěn)定性9.耐藥細(xì)胞株ABC家族蛋白及腫瘤干性蛋白的表達(dá)采用Western blotting檢測(cè)方法,檢測(cè)誘導(dǎo)培養(yǎng)的耐藥細(xì)胞株ABC家族蛋白ABCB1、ABCC1C、ABCF2及腫瘤干性蛋白Sox2、Nanog的表達(dá)情況。10.多烯磷脂酰膽堿對(duì)耐藥株的奧沙利鉑敏感指數(shù)的影響檢測(cè)經(jīng)與0.25umol/L、0.5umol/L、lumol/L、2umol/L多烯磷脂酰膽堿作用48h后,檢測(cè)各個(gè)分組中SGC-7901/L-OHP對(duì)于L-0HP的IC50,計(jì)算其藥物逆轉(zhuǎn)指數(shù)。10.SGC-7901/L-OHP耐藥株側(cè)群細(xì)胞表達(dá)比例將 SGC-7901 與 SGC-7901/L-OHP 細(xì)胞經(jīng) Hoechst 33342 孵育 90min 后流式細(xì)胞儀檢測(cè),計(jì)算其各組SP細(xì)胞比例。11.多烯磷脂酰膽堿對(duì)耐藥株ABC家族蛋白及腫瘤干性蛋白改變采用Western blotting檢測(cè)方法,檢測(cè)誘導(dǎo)培養(yǎng)的耐藥細(xì)胞株ABC家族蛋白ABCF2及腫瘤干性蛋白Nanog的表達(dá)情況結(jié)果:奧沙利鉑抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),且抑制強(qiáng)度與藥物濃度及作用時(shí)間有關(guān)(F=194.193,P=0.0027;F=12.428,P=0.01)。不同濃度的多烯磷脂酰膽堿對(duì)胃癌SGC-790細(xì)胞的增殖活性不同,低濃度多烯磷脂酰膽堿可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖(F=373.769,P0.01),高濃度多烯磷脂酰膽堿可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖。將不同濃度多烯磷脂酰膽堿與奧沙利鉑聯(lián)用后,Ⅰ、Ⅰ、Ⅲa-f組的細(xì)胞存活率分別為:100±0.18%,67.8±4.0%,38.9±4.7%,34.9±3.4%,39.3±5.5%,38.6±4.60%,37.7±2.6%,36.1±5.1%,聯(lián)合作用組中藥物合用指數(shù),Q值分別為3.1、2.89、1.7、1.41、0.94和0.89。胃癌細(xì)胞在奧沙利鉑與0-64μmol/L的多烯磷脂作用后Ⅰ、Ⅰ、Ⅲa-f組的G0/G1期細(xì)胞的比例分別是45.5±1.68%,68.1± 1.02%,86.5± 1.21%,87.2± 1.25%,87.8± 1.07%,86.1± 1.60%,87.9± 1.56%,90.1±1.11%,凋亡比例分別為 2.75±1.23%、9.5±1.45%、23.2±0.97%、27.5± 1.66%、22.2±1.39%、23.4±1.23%,24.1±1.31%、21.2± 1.13%,均較空白對(duì)照組明顯增高,但是不同濃度多烯磷脂酰膽堿組間無(wú)明顯差別(P=0.46;P=0.75)。Ⅰ、Ⅰ、Ⅲa-f組超氧化物歧化酶活性(SOD)分別為:40.8±1.81,23.5±1.68,22.5±1.21,21.8±1.76,22.7±1.70,20.7士 1.35,19.2±1.76,21.6±1.59U/mgprot,谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性(GSH-Px)分別為:25.3±1.15,11.9±1.57,10.9±1.10,11.2±1.85,10.4±1.97,11.1±1.60,11.9±0.97,10.4±1.34 U/mg prot,活性和丙二醛含量(MDA)分別為:4.1±0.13,8.3±0.36,8.2±0.76,8.6±0.59,7.9±1.03,8.1±0.65,8.0±0.77,7.6±0.89nmol/mg prot,在聯(lián)合作用組較單藥奧沙利鉑組中表達(dá)無(wú)差別(P=0.88)。Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示,奧沙利鉑作用胃癌細(xì)胞48h后,Cytochrome c在細(xì)胞液中的表達(dá)明顯提高,同時(shí)發(fā)現(xiàn)凋亡前蛋白Bax表達(dá)明顯增加而凋亡蛋白Bcl-2明顯降低,而caspase-9和caspase-3均被分解成具有功能活性的片段,多烯磷脂酰膽堿可增強(qiáng)奧沙利鉑的上述作用,但其增強(qiáng)作用與多烯磷脂酰膽堿濃度無(wú)明顯相關(guān)(P=0.35)。細(xì)胞周期調(diào)控蛋白表達(dá)的結(jié)果顯示,奧沙利鉑降低了細(xì)胞因子D1和E的表達(dá),與多烯磷脂酰膽堿聯(lián)合作用后,奧沙利鉑抑制細(xì)胞因子D1和E表達(dá)的作用進(jìn)一步增強(qiáng)(P=0.027),但在不同濃度中的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.37)。誘導(dǎo)建立胃癌耐藥細(xì)胞SGC-7901/L-OHP,使其可以在10μg/ml的奧沙利鉑中穩(wěn)定存活,Western blot檢測(cè)ABC蛋白超家族結(jié)果顯示,SGC-7901/L-OHP細(xì)胞與SGC-7901細(xì)胞中耐藥基因ABCB1、ABCC1均低表達(dá),SGC-7901/L-OHP細(xì)胞ABCF2蛋白的高表達(dá),腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物Sox2、Nanog結(jié)果顯示,SGC-7901/L-OHP細(xì)胞與SGC-7901細(xì)胞中干細(xì)胞標(biāo)志物Sox2均無(wú)明顯表達(dá),SGC-7901/L-OHP細(xì)胞Nanog蛋白的高表達(dá)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)SGC-7901與SGC-7901/L-OHP 和細(xì)胞中 SP 比例分別為 0.12±0.035%和 85.7±9.66%,兩者之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。經(jīng)與0.25umol/L、0.5umol/L、lumol/L、2umol/L多烯磷脂酰膽堿聯(lián)合作用,SGC-7901/L-OHP細(xì)胞對(duì)于奧沙利鉑敏感性增加,藥物逆轉(zhuǎn)指數(shù)分別為:4.24、6.09、3.80、2.15。同時(shí)發(fā)現(xiàn)各組SGC-7901/L-OHP細(xì)胞Nanog及ABCF2蛋白的表達(dá)均明顯降低(P=0.023)。結(jié)論:1.奧沙利鉑對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖起到抑制作用,其作用呈現(xiàn)出明顯的劑量和時(shí)間依賴性。2.不同濃度的多烯磷脂酰膽堿對(duì)胃癌SGC-790細(xì)胞的增殖活性因濃度不同而表現(xiàn)出兩面性,低劑量多烯磷脂酰膽堿促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖,高劑量多烯磷脂酰膽堿抑制腫瘤細(xì)胞增殖。3.藥物聯(lián)合公式顯示,低濃度多烯磷脂酰膽堿(2-16μmol/L)與奧沙利鉑呈現(xiàn)出協(xié)同抗胃癌增殖的作用。高濃度多烯磷脂酰膽堿(32-64μmol/L)與奧沙利鉑呈現(xiàn)出單純相加抗胃癌增殖的作用。4.聯(lián)合作用組及單藥組SOD、GSH-Px活性和MDA水平無(wú)差異,顯示兩藥聯(lián)合抗腫瘤作用與細(xì)胞活性氧(ROS)無(wú)明顯相關(guān)。5.奧沙利鉑抗腫瘤增殖作用為促使細(xì)胞增殖周期停滯并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。6.多烯磷脂酰膽堿增強(qiáng)奧沙利鉑誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期停滯的作用,主要通過(guò)上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白染色質(zhì)c及激活其下游蛋白caspase-9、和caspase-3,并下調(diào)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白細(xì)胞因子D1和E的表達(dá)水平,但兩者協(xié)同抗腫瘤作用與多烯磷脂酰膽堿濃度無(wú)明顯相關(guān)。7.SGC-7901/L-OHP細(xì)胞較SGC-7901細(xì)胞中SP高表達(dá),同時(shí)出現(xiàn)Nanog及ABCF2蛋白的高表達(dá)。8.多烯磷脂酰膽堿可以恢復(fù)SGC-7901/L-OHP細(xì)胞對(duì)于奧沙利鉑敏感性,其中,0.5umol/l多烯磷脂酰膽堿耐藥指數(shù)最強(qiáng)。9.多烯磷脂酰膽堿逆轉(zhuǎn)SGC-7901/L-OHP細(xì)胞對(duì)于奧沙利鉑耐藥,考慮與降低耐藥細(xì)胞Nanog及ABCF2蛋白的表達(dá)有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1292594