本文關(guān)鍵詞：低強度超聲激勵微泡的血管效應(yīng)及其在腫瘤治療中的應(yīng)用研究

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【摘要】：研究背景:低強度超聲治療在促進(jìn)骨愈合、軟骨修復(fù)、加速糖尿病足潰瘍恢復(fù)、緩解慢性炎癥疼痛等大量臨床實踐中被證實具有穩(wěn)定而可靠的治療效果。在腫瘤治療研究領(lǐng)域,近年來有大量體外及動物實驗證實,低強度超聲可以在腫瘤治療中起到一定的作用。低強度超聲治療對腫瘤的作用包括兩方面:直接損傷作用殺傷腫瘤細(xì)胞/組織,如聲動力學(xué)療法;間接增強其他治療手段對腫瘤組織的殺傷作用,如通過超聲空化、聲孔效應(yīng)等增強放療、化療、基因轉(zhuǎn)染療效。近年挪威的一項I期臨床實驗證實,低強度超聲聯(lián)合微泡可以顯著增強胰腺癌患者吉西他濱化療療效。微泡具有降低超聲空化閾值、增強超聲空化效應(yīng)的作用。大量在體研究證實,血管內(nèi)微泡在低強度超聲輻照下會產(chǎn)生顯著的血流阻斷效應(yīng),引起腫瘤毛細(xì)血管擴張、水腫、出血等病理損傷,顯著降低腫瘤血流灌注,并繼而引起腫瘤細(xì)胞壞死、腫瘤生長抑制等。低強度超聲引起腫瘤血流灌注下降的效應(yīng)被稱為超聲的抗血管效應(yīng)。然而同時也有研究證實,低強度超聲輻照聯(lián)合微泡還可引起血管擴張及血流灌注增加。暫時性的腫瘤血流灌注量增加有助于改善腫瘤乏氧、乏血供狀態(tài),緩解腫瘤局部低pH、高組織間隙壓力的微環(huán)境,從而增強腫瘤細(xì)胞對化療及放療的敏感性,增強腫瘤放化療的療效。低強度超聲激勵微泡空化作用的血管效應(yīng)多樣性與腫瘤組織血管結(jié)構(gòu)的不均質(zhì)性以及超聲空化效應(yīng)的復(fù)雜性均有關(guān)系。超聲脈沖寬度、重復(fù)頻率、聲壓等參數(shù)的改變均會影響超聲空化效應(yīng)的類型(穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)空化)及強度,從而影響其血管效應(yīng)�；谏鲜鲈�,我們分別采用高聲壓治療超聲儀以及改進(jìn)的可調(diào)控診斷超聲儀對動物腫瘤模型進(jìn)行不同能量參數(shù)的低強度超聲激勵微泡空化實驗,旨在觀察不同類型的低強度超聲激勵微泡空化的血管影響效應(yīng),并進(jìn)一步探究其在腫瘤治療中的可能應(yīng)用。目的:1.研究高聲壓低強度超聲激勵微泡空化阻斷腫瘤血流對腫瘤無水酒精消融的增強作用。2.研究診斷級低強度超聲激勵微泡空化對肌肉及腫瘤組織的血管效應(yīng)及其機制,進(jìn)一步探討低強度超聲激勵微泡空化增敏腫瘤化療的可能。材料與方法:1.主要實驗儀器:(1)ACUSON S2000超聲診斷儀,配備9L4高頻線陣探頭,用于低強度超聲激勵微泡空化阻斷腫瘤血流實驗中腫瘤常規(guī)超聲及超聲造影成像。(2)CZ-960脈沖式超聲治療儀,探頭頻率831 kHz,用于低強度超聲激勵微泡空化阻斷腫瘤血流實驗。本研究所采用的超聲參數(shù)為:超聲脈沖寬度300個周期(約0.36 ms),脈沖重復(fù)頻率10 Hz(脈沖間隔約100 ms)、峰值負(fù)壓4.3 MPa,發(fā)射/間歇時間6s/6s,總工作時間5 min,經(jīng)換算占空比為0.18%,平均聲強1.25 W/cm2。(3)經(jīng)過適應(yīng)性改進(jìn)的彩色多普勒超聲診斷儀VINNO 70,配備X4-12L線陣探頭,飛依諾科技(蘇州)有限公司生產(chǎn),具備專門的微泡空化調(diào)控組件Vflash。該組件在低機械指數(shù)超聲造影成像程序上疊加可調(diào)式Vflash治療脈沖超聲波發(fā)射程序,具有在低機械指數(shù)造影模式下實時監(jiān)測瞬時Vflash脈沖發(fā)射的功能。本研究所采用的診斷級低強度超聲參數(shù)為:探頭頻率4 MHz,脈沖寬度18個周期(約4.5μs),脈沖重復(fù)頻率50 Hz,發(fā)射/間歇時間0.48 s/2 s,線密度4檔,聲功率50%/100%(分別對應(yīng)機械指數(shù)0.7/1.4),總輻照時間10 min/20 min。(4)Varioskan Flash全波長多功能酶標(biāo)儀,美國賽默飛世爾科技公司生產(chǎn),可進(jìn)行熒光和化學(xué)發(fā)光、光吸收檢測。(5)Waters Alliance E2695高效液相色譜儀,沃特世科技(上海)有限公司生產(chǎn),HPLC分離系統(tǒng)用于組織藥物濃度檢測。2.主要實驗試劑:(1)“脂氟顯”微泡造影劑,為第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院超聲科研制實驗用試劑,外層為脂質(zhì)成分包膜,核心氣體為惰性氣體全氟丙烷,微泡平均粒徑2.0μm,濃度2-9×109/ml。在本研究中作為造影劑及空化核應(yīng)用于超聲造影成像及低強度超聲空化治療。(2)一氧化氮檢測試劑盒(S0021)及組織與細(xì)胞裂解液(一氧化氮檢測用)(S3039),購自碧云天生物技術(shù)有限公司,采用經(jīng)典Griess法測定一氧化氮濃度。(3)熒光素鈉鹽,購自美國Sigma公司,為小分子熒光物質(zhì),分子量376.27。(4)BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0012S),購自碧云天生物技術(shù)有限公司,采用BCA法測定蛋白濃度,用于一氧化氮及熒光素鈉濃度檢測的蛋白濃度標(biāo)定。3.實驗動物:(1)健康4周齡SD乳鼠3只,雌雄不限,用于Walker-256腹水原代腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)。(2)健康雌性SD大鼠28只,體質(zhì)量160-180g,建立單側(cè)皮下Walker-256腫瘤模型,用于低強度超聲激勵微泡空化阻斷腫瘤血流增強無水酒精消融實驗。(3)健康雄性6周齡裸鼠40只,體質(zhì)量12-15g,用于診斷級低強度超聲激勵微泡空化對肌肉組織血管影響效應(yīng)的觀察及機制研究。(4)健康雄性4周齡裸鼠44只,體質(zhì)量10-12g,32只建立雙側(cè)下肢皮下胰腺癌腫瘤模型,用于診斷級低強度超聲激勵微泡空化對腫瘤組織血管影響效應(yīng)的觀察及其機制研究;另12只建立單側(cè)下肢腫瘤模型,用于診斷級低強度超聲激勵微泡空化增敏腫瘤化療實驗研究。4.實驗方法:(1)高聲壓低強度超聲激勵微泡空化阻斷腫瘤血流增強無水酒精消融研究:(1)動物模型建立:Walker-256腫瘤細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇培養(yǎng),待細(xì)胞濃度達(dá)107/ml時,接種于4周齡乳鼠腹腔,待腹水生成后抽取腹水并提取原代腫瘤細(xì)胞,以0.1 ml細(xì)胞懸液(5-8×107/ml)注射于28只6周齡SD大鼠皮下建立下肢荷Walker-256腫瘤模型。(2)高聲壓低強度超聲治療:荷瘤鼠隨機分為3組,分別為超聲治療組(n=8)、無水酒精注射組(n=10)以及超聲聯(lián)合酒精組(n=10)。超聲治療組經(jīng)尾靜脈緩慢推注稀釋的脂質(zhì)微泡0.5 ml(濃度約5×108/ml),同時使用高聲壓低強度超聲于腫瘤表面輻照5 min;無水酒精注射組于超聲引導(dǎo)下瘤內(nèi)注射無水酒精0.3 ml;超聲聯(lián)合酒精組首先對腫瘤進(jìn)行低強度超聲激勵微泡空化阻斷腫瘤血流治療,隨后于瘤內(nèi)注射等量無水酒精。(3)血流阻斷效應(yīng)評價指標(biāo):治療前、治療后即刻(除無水酒精注射組外)及24小時行超聲造影檢查并定量分析腫瘤區(qū)域時間強度曲線,得到峰值強度(Peak Intensity,PI)、曲線下面積(Area Under Curve,AUC)、達(dá)峰時間(Time to Peak,Tp)以及平均渡越時間(Mean Transit Time,MTT)值進(jìn)行統(tǒng)計分析;取動物腫瘤標(biāo)本3個不相鄰切面計算壞死區(qū)面積/整體面積得到腫瘤壞死率。(2)診斷級低強度超聲激勵微泡空化對正常肌肉血管效應(yīng)的觀察及其機制研究:(1)動物分組及低強度超聲治療:40只健康裸鼠根據(jù)所采用的超聲治療參數(shù)變量——機械指數(shù)(Mechanical Index,MI)及治療時間(Time,T)隨機分入四組(n=10):MI0.7T10 min組,MI0.7T20 min組,MI1.4T10 min組,MI1.4T20 min組,每組10只。經(jīng)尾靜脈團(tuán)注脂質(zhì)微泡造影劑0.02 ml同時使用相應(yīng)參數(shù)(MI=0.7/1.4,T=10/20 min)的診斷級低強度超聲在單側(cè)肢體表面行超聲輻照。(2)血流灌注增強效應(yīng)評價指標(biāo):各組治療前后對雙側(cè)小腿肌肉群同時行超聲造影檢查并定量分析對應(yīng)肌肉區(qū)域時間強度曲線,分別得到治療側(cè)及對照側(cè)治療前后PI值及AUC值,計算治療側(cè)與對照側(cè)比值PIT/PIC及AUCT/AUCC,統(tǒng)計分析治療前后兩組比值間差異。(3)一氧化氮濃度檢測:每組5只動物,分別獲取治療側(cè)及對照側(cè)肌肉,按說明書步驟檢測一氧化氮濃度。(4)熒光素鈉滲出量檢測:每組5只動物于治療開始前注射0.5%熒光素鈉溶液0.2ml,治療后造影結(jié)束后經(jīng)心臟灌注排盡血流后獲取治療側(cè)及對照側(cè)肌肉組織,充分勻漿離心后取上清,測定激發(fā)光波長437 nm,發(fā)射光518 nm波段熒光強度,計算熒光素鈉滲出量。(3)診斷級低強度超聲激勵微泡空化對腫瘤血管效應(yīng)的觀察及其增敏化療的效應(yīng)研究:(1)32只雙側(cè)荷瘤裸鼠,動物分組、低強度超聲治療、血流灌注評價、一氧化氮濃度檢測以及熒光素鈉滲出量檢測方法同第(2)部分。(2)診斷級低強度超聲激勵微泡空化增敏化療作用研究:12只單側(cè)下肢皮下荷瘤鼠,隨機分入超聲+吉西他濱組(US+GEM,n=6)和單獨吉西他濱組(GEM,n=6)。US+GEM組經(jīng)靜脈注射化療藥物吉西他濱后,進(jìn)行低強度超聲聯(lián)合微泡治療;GEM組僅經(jīng)靜脈注射化療藥物。超聲治療參數(shù)選擇MI=0.7,治療時間20 min。于治療結(jié)束后處死動物獲取腫瘤組織,高效液相色譜法測定組織藥物濃度。結(jié)果:1.高聲壓低強度超聲激勵微泡空化阻斷腫瘤血流增強無水酒精消融研究:(1)超聲治療組和聯(lián)合治療組治療后即刻造影均可見腫瘤內(nèi)部大范圍非增強負(fù)性顯影,PI值及AUC值與治療前比較均有顯著下降(P0.05);與治療前相比,24 h后各組腫瘤造影PI值及AUC值均有顯著下降,其中超聲空化組PI值下降了30.9%,AUC值下降了43.4%,無水酒精消融組PI值下降了46.3%,AUC值下降了52.5%,聯(lián)合治療組PI值下降了84.8%,AUC值下降了90.1%,其差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);(2)各組腫瘤壞死率分別為:超聲空化組(66.17±12.54)%,無水酒精消融組(81.02±8.23)%,聯(lián)合治療組(97.50±1.84)%,聯(lián)合治療組腫瘤壞死率顯著高于其他兩組(P0.01)。病理觀察可見各組腫瘤內(nèi)部均為大范圍凝固性壞死。2.診斷級低強度超聲激勵微泡空化對正常肌肉血管效應(yīng)的觀察及其機制研究:(1)超聲空化治療后,MI0.7T10 min組、MI0.7T20 min組、MI1.4T10 min組、MI1.4T20 min組治療側(cè)與對照側(cè)肌肉峰值強度比(PIT/PIC)較治療前分別增加了7%,18%,16%,9%,而曲線下面積比(AUCT/AUCC)分別增加了約9%,28%,31%,15%,統(tǒng)計學(xué)結(jié)果顯示各組治療后PIT/PIC及AUCT/AUCC值較治療前均有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。(2)超聲治療后各組治療測NO濃度均高于對照側(cè)(P0.05),而NaFI濃度與對照測比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。3.診斷級低強度超聲激勵微泡空化對腫瘤血管效應(yīng)的觀察及其增敏化療的效應(yīng)研究:(1)超聲空化治療后四組治療側(cè)與對照側(cè)腫瘤組織峰值強度比(PIT/PIC)及曲線下面積比(AUCT/AUCC)與治療前比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。(2)超聲空化治療后各組治療測NO濃度與對照側(cè)比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05).(3)超聲空化治療后MI0.7T20 min組腫瘤治療側(cè)與對照側(cè)NaFI滲出量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),其余各組均無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。(4)治療參數(shù)為MI0.7T20 min組低強度超聲激勵微泡聯(lián)合經(jīng)靜脈化療藥物治療后,US+GEM組藥物濃度較GEM組增加了約2.5倍,兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1.高峰值負(fù)壓的低強度超聲聯(lián)合微泡作用可引起腫瘤血流灌注量的顯著下降,與經(jīng)皮瘤內(nèi)無水酒精注射療法聯(lián)合使用能夠增強其消融作用,增加腫瘤壞死率;2.診斷級低強度超聲刺激微泡空化效應(yīng)可引起正常肌肉組織血流灌注量的顯著增加及一氧化氮生成量的增加。3.診斷級低強度超聲(MI0.7T20min)刺激微泡空化作用可引起裸鼠皮下胰腺癌腫瘤模型小分子藥物通透性升高,增加局部藥物濃度。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R730.5;R454.3

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3 姜學(xué)平;程茜;錢夢，

本文編號：1291873