本文關(guān)鍵詞：全基因組DNA甲基化參與胃癌發(fā)生發(fā)展的機制研究

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【摘要】：胃癌是嚴(yán)重危害我國居民身心健康的常見消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,由于缺乏早期、特異、敏感的篩查和診斷指標(biāo),給胃癌的早期診斷和治療帶來極大的困難和挑戰(zhàn)。因此,加強對胃癌病因?qū)W、發(fā)病機制及預(yù)后因素的研究,篩選可靠的可用于預(yù)測胃癌發(fā)病及預(yù)后的生物標(biāo)志物,對今后胃癌的預(yù)防、干預(yù)、治療和預(yù)后判斷均具有重要的意義。胃癌的發(fā)生發(fā)展及臨床轉(zhuǎn)歸是涉及遺傳和表觀遺傳改變所致細胞調(diào)節(jié)和生長失控的多階段復(fù)雜過程,是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結(jié)果。大量的流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)表明,幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,HP)感染、飲食因素(高鹽、含N-亞硝基化合物、新鮮蔬菜和水果攝入不足)、吸煙、肥胖、家族遺傳史等都與胃癌的發(fā)生風(fēng)險密切相關(guān)。各種環(huán)境危險因素在不同階段作用于不同基因,引起表觀遺傳的改變,繼而導(dǎo)致相關(guān)基因活性和表達水平的改變,這些基因環(huán)境之間的交互作用,最終導(dǎo)致胃癌的發(fā)生發(fā)展。機體參與環(huán)境應(yīng)答的關(guān)鍵調(diào)控之一是基因組調(diào)控區(qū)域的甲基化,基因啟動子區(qū)的CpG島的甲基化在調(diào)控基因表達方面發(fā)揮重要作用,但是在全基因組水平揭示DNA異常甲基化參與胃癌發(fā)生發(fā)展的機制的研究目前還很匱乏,而且基因調(diào)控區(qū)的異常甲基化參與胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機制并沒有被完全闡明。此外,位于基因調(diào)控區(qū)CpG島的遺傳變異(主要是單核苷酸多態(tài)性,SNP)是否可以調(diào)控表觀遺傳效應(yīng),共同參與胃癌的發(fā)生和臨床轉(zhuǎn)歸還有待進一步研究。本研究擬在全基因組水平探討表觀遺傳機制,以及遺傳與表觀遺傳的交互效應(yīng)參與胃癌發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后的分子機制,以期為胃癌的早期預(yù)防、病因?qū)W研究以及預(yù)后判斷提供基礎(chǔ)研究證據(jù)。第一部分高甲基化基因及CCNMA1通過調(diào)控PTK2參與胃癌發(fā)生發(fā)展的機制研究研究背景基因啟動子區(qū)的甲基化在調(diào)控基因表達方面發(fā)揮重要作用,由于啟動子高甲基化導(dǎo)致的抑癌基因失活,在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色。但是在全基因組水平揭示DNA異常甲基化參與胃癌發(fā)生發(fā)展機制的研究目前還很匱乏,所以在全基因組水平揭示胃癌發(fā)生過程中的甲基化水平差異顯得尤為必要和迫切。研究方法本研究收取12位胃癌患者的癌組織及其癌旁正常組織,提取組織DNA,亞硫酸鹽修飾后,采用Illumina Human甲基化450K芯片檢測胃癌患者癌與癌旁組織全基因組的甲基化水平差異,并采用甲基化特異性PCR(methylation-specific PCR,MSP)和亞硫酸鹽測序法(bisulphite sequencing,BSP)的方法進一步驗證特異性CpG島在癌和癌旁的甲基化水平差異,然后通過生物信息學(xué),細胞表型實驗,以及動物實驗探索目的基因KCNMA1與下游靶基因之間的調(diào)控關(guān)系,最后使用Kaplan-Meier生存曲線評估KCNMA1啟動子高甲基化對于胃癌預(yù)后的影響。研究結(jié)果系統(tǒng)分析芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn),位于基因KCNMA1啟動子區(qū)的CpG位點cg24113782具有最顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P = 0.006),cg24113782參與調(diào)控基因KCNMA1在胃癌組織和胃癌細胞中的表達沉默。進一步在112對組織中驗證發(fā)現(xiàn),癌組織中KCAM41基因啟動子區(qū)發(fā)生甲基化的比例為66.7%(77/112),而癌旁中發(fā)生甲基化的比例僅為16.2%(18/112),生存分析提示KCNMA1啟動子區(qū)的高甲基化預(yù)示胃癌患者不良的預(yù)后結(jié)局(P= 0.036)。體外實驗表明在胃癌細胞中過表達KCNMA1表達質(zhì)粒能明顯抑制細胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性表型(P0.001),采用流式細胞儀研究發(fā)現(xiàn)KCNMA1主要是通過促進腫瘤細胞凋亡,進而調(diào)控細胞的惡性表型;裸鼠荷瘤實驗也發(fā)現(xiàn),過表達KCNMA1能明顯抑制腫瘤細胞在裸鼠體內(nèi)的增殖,過表達KCNMA1的瘤體生長速度明顯下降(P0.001)。進一步的研究我們發(fā)現(xiàn)KCNMA1發(fā)揮抑癌效應(yīng),主要是通過降低FAK凋亡通路促癌基因PTK2的表達,進而影響胃癌細胞凋亡進程實現(xiàn)的。研究結(jié)論本項研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中啟動子區(qū)異常高甲基化基因KCNMA1通過調(diào)控PTK2的表達參與胃癌的發(fā)生發(fā)展,它的啟動子區(qū)高甲基化是預(yù)測胃癌患者預(yù)后的獨立預(yù)測指標(biāo)。第二部分基于全基因組的DNA甲基化相關(guān)SNPs(CpG-SNPs)與胃癌發(fā)病風(fēng)險的關(guān)聯(lián)及其機制研究研究背景大量的研究已經(jīng)證實位于基因組DNA上的SNPs可以影響其本身或者附近CpG位點的甲基化狀態(tài),導(dǎo)致攜帶不同等位基因的個體,SNPs所在宿主CpG島甲基化水平的差異。SNPs可能通過改變其所在CpG島的甲基化狀態(tài),干擾轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合,進而影響下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。因此,在全基因組水平探討遺傳變異與表觀遺傳的交互效應(yīng),能夠為揭示胃癌發(fā)生風(fēng)險相關(guān)SNPs位點的生物學(xué)功能開辟新的研究思路。研究方法本研究結(jié)合胃癌全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association study,GWAS)的數(shù)據(jù),并通過ENCODE(encyclopedia of DNA elements)數(shù)據(jù)庫,獲得全基因組內(nèi)的所有CpG島的基因組物理位置,采用Illumina 660W Quad chip對這個區(qū)域內(nèi)的所有SNPs進行基因分型,并采用一系列分子生物學(xué)方法,探索顯著關(guān)聯(lián)SNPs調(diào)控其宿主CpG島的甲基化水平的分子機制,以及相關(guān)基因的分子功能。研究結(jié)果:首先對所有CpG島內(nèi)的SNPs進行基因分型,并計算其OR值和95%CI,采用Bonferroni校正后,發(fā)現(xiàn)位于假基因(pseudogene)GBP1啟動子區(qū)的遺傳變異rs2990245與胃癌的發(fā)生風(fēng)險顯著相關(guān),在顯性模型中,相對于攜帶TT基因型的個體,攜帶CT和CC基因型的個體罹患胃癌的風(fēng)險減少20%(OR = 0.80,95%CI = 0.68-0.94,P=0.0076);隱性模型的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)相對于攜帶TT和CT基因型的個體,攜帶CC基因型者發(fā)生胃癌的風(fēng)險顯著降低(OR = 0.40,95%CI= 0.24-0.65,P= 0.0002)。進一步的研究發(fā)現(xiàn)rs2990245可以通過影響GBAP1的啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài),進而調(diào)控GB4P1的表達。雙熒光實驗表明,rs2990245T等位基因的轉(zhuǎn)錄活性明顯高于C等位基因。此外,我們發(fā)現(xiàn)GBAP1在胃癌中顯著高表達,并且其在細胞質(zhì)中的表達明顯高于核內(nèi)的表達。更進一步的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)GBAP1可以扮演"內(nèi)源競爭性RNA"(competing endogenous RNAs,ceRNA)的角色,通過和其同源基因GB4競爭吸附miR-212-3p,解除miR-212-3p對GB4的抑制效應(yīng),上調(diào)基因GBA的表達。表達相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),GBAP1與GBA在胃癌組織中的表達呈現(xiàn)顯著的正相關(guān),且其表達相關(guān)性也被TCGA和GEO數(shù)據(jù)所證實。研究結(jié)論我們的研究結(jié)果表明rs2990245與中國人群的胃癌發(fā)病風(fēng)險顯著相關(guān),其可以通過調(diào)控GB4P1的啟動子區(qū)甲基化進而調(diào)控GBAP1的表達;GBAP1可以與其同源基因GB4競爭結(jié)合miR-212-3p,參與胃癌的發(fā)生發(fā)展。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.2

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

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本文編號：1291636